楊育林，吉瑩潔

(洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023)

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五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗證

楊育林，吉瑩潔

(洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023)

目的：建立五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法。方法：采用常規(guī)法、薄膜過濾法對五種醫(yī)院制劑進行方法驗證。結果：椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸可采用常規(guī)法，頸痛消丸、骨炎托毒丸須用薄膜過濾法除去其抑菌作用后方可進行微生物限度檢查。結論：確立了五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法，可有效控制其質量。

醫(yī)院制劑；微生物限度檢查；方法驗證

微生物限度是藥品安全性的重要指標之一，1995年版《中國藥典》 首次收載微生物限度檢查法，此后的三版藥典均對其進行了較大幅度的修訂、增訂，為其結果的可靠性提供了保障。然而現(xiàn)行的各類藥品標準所收載的各中藥制劑品種檢查項下，很少規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，這就要求我們對所采用的檢測方法進行驗證試驗，確保該方法的可靠性。椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸、頸痛消丸、骨炎托毒丸是河南省洛陽正骨醫(yī)院臨床使用廣泛的五種中藥制劑，本文參考有關資料[1-5]，對其微生物限度檢查方法進行考察，為以后檢驗提供參考依據。

1 材料

1.1 供試品

椎間盤丸(批號：20130604)、頑痹康丸(批號：20130203)、芪仲腰舒丸(批號：20130104)、頸痛消丸(批號：20130106)、骨炎托毒丸(批號：20130602)，均為河南省洛陽正骨醫(yī)院生產。

1.2 菌種

大腸埃希菌(CMCC(B) 44 102)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26 003)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63 501)、白色念珠菌(CMCC(F) 98 001)、黑曲霉菌(CMCC(F) 98 003)均由河南省食品藥品檢驗所提供。

1.3 培養(yǎng)基與稀釋液

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產；0.9%無菌氯化鈉溶液、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液由本所配制。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100cfu/mL的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24～48h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)1周，加入3～5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100cfu/mL的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL，制成1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.3.1 試驗組 常規(guī)法：取1∶10供試液1mL，分別人工接種50～100cfu上述5種陽性試驗菌株，立即傾注15～20mL瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結果。薄膜過濾法：取1∶10供試液10mL， 以500r/min離心3min，取1mL上清液加入薄膜過濾器中，過濾后用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300mL分3次沖洗。在最后一次沖洗液中加入50～100cfu試驗菌株，濾干，取出薄膜貼于瓊脂培養(yǎng)基上，規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結果。

2.3.2 菌液組 按試驗組各方法不加供試液操作，測定所加菌數，結果見表1。

表1 陽性菌計數 (cfu/mL)

2.3.3 供試品對照組 取供試液1mL，按試驗組操作，不加菌液，記錄菌落數。

2.3.4 稀釋劑對照組 取稀釋液1mL代替供試液，按試驗組操作，記錄菌落數。

2.3.5 回收率計算 試驗組的菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%;稀釋劑對照組的菌回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數×100%;依法計算回收率，稀釋劑對照組的菌回收率均高于70%，試驗組的菌回收率見表2/表3。

表2 常規(guī)法試驗組菌的平均回收率 (%)

表3 薄膜過濾法試驗組菌的平均回收率 (%)

2.4 控制菌檢查方法驗證

取4瓶膽鹽乳糖培養(yǎng)基(100mL/瓶)，其中3瓶分別加入1∶10 供試液10mL，一瓶作為樣品組，另一瓶加入50～100cfu大腸埃希菌作為陽性對照組，第三瓶加入50～100cfu金黃色葡萄球菌作為陰性菌對照組；剩余一瓶加入10mL稀釋劑作為陰性對照；置35℃培養(yǎng)18～24h后，進行MUG及靛基質試驗，結果見表4。

表4 控制菌方法驗證結果

3 討論

由表2可見，采用常規(guī)法時椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸對各試驗菌的回收率均高于70%，證明無明顯抑菌現(xiàn)象；而頸痛消丸和骨炎托毒丸對某些試驗菌的回收率低于70%，說明其有明顯的抑菌作用,因此，應重新驗證。從表3可以看出，在改用薄膜過濾法后，頸痛消丸和骨炎托毒丸對各試驗菌的回收率均高于70%，表明其抑菌作用已消除。由表4可以看出，各供試品對控制菌無明顯抑制作用。

根據以上分析，可以確立椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸采用常規(guī)法進行細菌數的檢查，頸痛消丸和骨炎托毒丸采用薄膜過濾法進行細菌數的檢查；上述五種醫(yī)院制劑的霉菌及酵母菌數檢查和控制菌檢查均可采用常規(guī)法進行。

驗證試驗時，試驗用菌株的傳代次數不宜超過5代，并應采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證其生物學特性。菌液制備后應在規(guī)定期限內使用，菌數應符合藥典要求。

藥典收載的離心沉淀法僅適用于制備細菌計數或控制菌檢查用的供試液，500r/min離心3min只用于去除供試液中的沉淀物，不宜采用高速或長時離心沉降集菌，以免影響供試品中微生物的回收，造成檢驗結果不能真實反映供試品的污染情況。

測定回收率時，供試液加入菌液后，應及時傾注培養(yǎng)基，以避免有抑菌性的供試液對菌液中的活菌造成損害，影響回收率。

[1] 國家藥典委員會. 中國藥典(一部)[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄79-88.

[2] 中國藥品生物制品檢定所,中國藥品檢驗總所. 中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351-407.

[3] 蘇德模,馬續(xù)榮. 藥品微生物學檢驗技術[M]. 北京:華齡出版社,2007:221-227.

[4] 宋勤,杜平華. 中成藥微生物限度檢查方法的探討[J]. 中國藥事,2006,20(1):46-48.

[5] 楊靜. 藥品微生物限度檢查法的影響因素分析[J]. 中國藥事,2008,22(12):1095-1096.

(責任編輯：宋勇剛)

Verification of Methodology on the Microbial Limit Test for Five Hospital Preparations

Yang Yulin，Ji Yingjie

(Luoyang Institute for Food and Drug Control, Henan 471023, China)

Objective:To establish methods of the microbial limit test for five hospital preparations. Methods:Common method and membrane filtration method were used for the verification of methodology on five hospital preparations. Results:The results suggested that common method be used for Zhuijianpan pills, Wanbikang pills and Qizhongyaoshu pills; membrane filtration method for Jingtongxiao pills and Guyantuodu pills. Conclusion:Methods of the microbial limit test for five hospital preparations were established, and its can be used for quality control of those preparations.

Hospital Preparations; Microbial Limit Tests; Verification of Methodology

2014-08-20

楊育林(1978-)，男，河南省洛陽市食品藥品檢驗所主管藥師，研究方向為藥品檢驗。

R283

A

1673-2197(2014)23-0024-02