【關(guān)鍵詞】米曲霉轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉；γ-氨基丁酸；研究

639文章編號(hào)：1004-7484（2014）-06-3504-03

米曲霉是一種安全有益的菌種，利用米曲霉轉(zhuǎn)化MSG（谷氨酸鈉，以下簡(jiǎn)稱MSG）生成GABA（γ-氨基丁酸，以下簡(jiǎn)稱GABA）能提高制作GABA的安全性，達(dá)到食用級(jí)。

1米曲霉生成顆粒型的米曲霉菌球方法

1.1米曲霉菌球活化從保存培養(yǎng)基菌種中接種于平面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，恒溫箱中培養(yǎng)3天。之后，接種3環(huán)于200mL培養(yǎng)基（500mL三角瓶），于28℃、160r/min搖床中培養(yǎng)2天。

1.2米曲霉菌球酶活的測(cè)定取1g米曲霉菌球加入到50mL含1%MSG的醋酸-醋酸鹽緩沖液（0.2mol/LpH4.6）中，37℃、140r/min搖床反應(yīng)2h。0.22μm微濾膜過(guò)濾后，收集過(guò)濾液，測(cè)定GABA含量，計(jì)算酶活。

酶活U：在37℃，140rpm的搖床中反應(yīng)1h，轉(zhuǎn)化生成1μmol GABA的酶量。

1.3菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶關(guān)系的研究將活化后的米曲霉2%（v/v）轉(zhuǎn)接到200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，共16瓶，每12h取出2瓶作為研究，濾紙過(guò)濾收集菌球，測(cè)定菌球濕重和酶活。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌球的酶活和菌體濕重為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶關(guān)系圖。

1.4米曲霉菌球的最適pH配制50mL不同pH濃度梯度的0.2mol/L醋酸鈉緩沖液（pH3.5-5.6，1%MSG），往中加入1g米曲霉菌球，37℃、140rpm下反應(yīng)2h取樣測(cè)定GABA含量，計(jì)算酶活，以最高的酶活力為參比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5米曲霉菌球的pH穩(wěn)定性稱取1g菌球加入至7mL不同pH的醋酸緩沖液中，室溫下保存2h后，于冷凍離心機(jī)中4℃、5000rpm離心10min，收集菌球。之后，加入到50mL含1%MSG的醋酸-醋酸鹽緩沖液（pH4.6），測(cè)定酶活，以最高的酶活為參比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.6米曲霉菌球的最適溫度分別在30，40，50和60℃不同溫度下，加入1g米曲霉菌球，37℃、140rpm下反應(yīng)2h取樣測(cè)定GABA含量，計(jì)算酶活，以最高的酶活力為參比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.7米曲霉菌球的溫度穩(wěn)定性稱取1g菌球加入至50mL醋酸鹽緩沖液（0.2mol/LpH4.6）中，分別在30℃，40℃，50℃和60℃不同溫度下保存2h。之后，往中加入1%MSG，37℃、140rpm的搖床中反應(yīng)2h，測(cè)定酶活，以最高的酶活為參比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.8化學(xué)物質(zhì)對(duì)米曲霉菌球酶活的影響分別在50mL醋酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH4.6，1%MSG）中加入CaCl2，F(xiàn)eCl3，KCl，KI，MgSO4，MnSO4，配置成含有1mM離子的緩沖液，測(cè)定這些離子對(duì)酶活的影響，以不添加以上化學(xué)物質(zhì)的酶活為參比計(jì)算相對(duì)酶活。

1.9米曲霉菌球米氏常數(shù)及最大反應(yīng)速率配制不同濃度谷氨酸鈉的酶反應(yīng)液體系（50-250mM），加入菌球1g，于37℃、140rpm搖床反應(yīng)1h，測(cè)定各反應(yīng)液中GABA含量，計(jì)算酶反應(yīng)速度，并以1/v-v/[S]作圖，其縱軸截距為1/Vmax，橫軸上的截距為-1/Km。

1.10產(chǎn)物的生成與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系在最適pH條件，同一反應(yīng)體系下，以2g菌球/100mL反應(yīng)體系的比例加入菌球，在不同的時(shí)間取樣500μL測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物GABA的生成量，以GABA含量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線。

1.11GABA定性檢測(cè)在電熱條件下，氨基酸與展層劑中的茚三酮反應(yīng)可以生成特異性的有色物質(zhì)，并根據(jù)GABA和MSG標(biāo)準(zhǔn)品在層析紙的位置，確定樣品中是否含有GABA和MSG。該方法的主要特點(diǎn)是省時(shí)、便捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確，適合定性研究氨基酸。其具體步驟如下：

展層劑的配制：組成為正丁醇：冰醋酸：去離子水=4：2：1，混合均勻，并加入0.4%的茚三酮充分溶解，避光密封放置于層析缸中備用。

準(zhǔn)確量取2μL溶液點(diǎn)樣于Whatman1號(hào)層析濾紙上，在層析缸中上行層析2h，吹干展開(kāi)劑后于65℃烘箱中顯色30min，即可得到紙譜圖。

2米曲霉菌球酶學(xué)性質(zhì)研究

2.1米曲霉菌球形態(tài)米曲霉菌球顆粒分明，形態(tài)以圓形為主。這些菌球的直徑大約在2-5mm左右，與海藻酸鈉固定化酶顆粒較為相似，具有易過(guò)濾的特性。

2.2GABA的定性測(cè)定。

條帶1、2和3分別為米曲霉菌球反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比液和米曲霉的發(fā)酵液。隨著層析液的流動(dòng)，氨基酸由于分子量不同，在層析紙上的流速不同，展現(xiàn)的位置也不一樣，可以定性地確定不同種類的氨基酸。從圖1中可知，條帶3中沒(méi)有GABA斑點(diǎn)，原因是發(fā)酵液的pH在6.5左右，不在菌球適宜pH范圍內(nèi)，抑制了菌球的酶活。然而，菌球催化反應(yīng)體系中卻有GABA，原因是反應(yīng)液的pH4.8在米曲霉菌球的適宜pH范圍內(nèi)。以上結(jié)果表明，米曲霉菌球在適宜的pH條件下可以催化反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化MSG成GABA。