【摘要】目的研究不同濃度的新疆黑蜂膠乙醇提取物對Balb/c小鼠淋巴細(xì)胞的增殖作用。方法新疆黑蜂膠經(jīng)乙醇提取混合物，做倍比稀釋。Balb/c小鼠脾淋巴細(xì)胞分別加入500μg/mL及倍比稀釋至15.6μg/mL的黑蜂膠共6個測定濃度，同時設(shè)脂多糖對照組、刀豆蛋白A對照組和空白對照組。采用CCK-8測定不同濃度黑蜂膠在體外刺激脾淋巴細(xì)胞后的OD450值。結(jié)果500μg/mL至62.5μg/mL的黑蜂膠刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖的活性顯著高于空白對照組（P<0.05），但低于ConA對照組（P<0.05）。黑蜂膠的免疫激活作用與其藥物濃度呈正相關(guān)（r=0.794，P<0.05）。結(jié)論新疆黑蜂膠可非特異性的促進(jìn)淋巴細(xì)胞顯著增殖。

【關(guān)鍵詞】新疆黑蜂膠；淋巴細(xì)胞；CCK-8

051文章編號：1004-7484（2014）-06-3045-02

蜂膠（Propolis）是醫(yī)學(xué)寶庫的古典名藥，已有數(shù)千年的歷吏。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠具有多種生物作用.如抗菌、消炎、止痛、抗腫瘤等。而新疆黑蜂膠產(chǎn)自新疆，其是否也存在上述藥效卻很少見諸文獻(xiàn)報道。研究新疆黑蜂膠調(diào)節(jié)小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用，可明確新疆黑蜂膠所具有的天然免疫學(xué)活性效果。本研究采用cck-8法檢測新疆黑蜂膠在體外對Balc/c小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激48小時后淋巴細(xì)胞增殖活性，初步探討其對淋巴細(xì)胞的免疫激活作用，對于有效的利用和開發(fā)這種新疆本土藥物資源提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物Balb/c小鼠：雌雄兼用，體重（18±2.0）g（由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）。

1.1.2黑蜂膠混合物新疆黑蜂膠產(chǎn)品（來自新疆伊犁尼勒克縣）

1.1.3實驗儀器與試劑試劑：小鼠淋巴細(xì)胞分離液TBD貨號：LTS1083；RPMI1640（Hyclone，美國，SH30809.01B）；CCK-8試劑（武漢博士德生物工程有限公司，AR1160）；豆蛋白（ConA）（Sigma195283；脂多糖（LPS）（SigmalL2630）95%無水乙醇。儀器：酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）iMark；細(xì)胞計數(shù)儀（BioRad T10）恒溫水浴箱等。

1.2方法

1.2.1獲取新疆黑蜂膠提取物（以1000mL計）將粗蜂膠置于-20℃冰箱中過夜后用研缽粉碎；水浴法（m：v=1：8）除蠟；冷浸法提純蜂膠，稱取15g除蠟蜂膠，按照固液比1：5的比例，加75%乙醇75ml，封口浸泡兩周；濾去沉渣，配制成100g/L蜂膠醇溶液，調(diào)整PH=7.0，使用0.2μm的無菌濾器過濾備用。

1.2.2制備小鼠脾細(xì)胞懸液頸椎脫臼法處死小鼠，無菌取脾臟置于培養(yǎng)皿中，用Hanks液沖洗，在含有4ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液的200目尼龍網(wǎng)無菌培養(yǎng)皿中碾磨過濾，移至15ml離心管中，加入2ml1640培養(yǎng)液，分離淋巴細(xì)胞并加入PBS離心洗滌3次，加入0.83%的氯化胺到洗過的細(xì)胞中，靜置5分鐘，去除血紅細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞并配制細(xì)胞工作液為5×105/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，細(xì)胞的終濃度為5×104/ml，邊緣孔用無菌PBS填充，37℃，5%CO2培養(yǎng)2小時加藥。

1.2.3實驗分組研究分為不同濃度蜂膠刺激組、ConA對照組、LPS對照組和空白對照組。其中蜂膠刺激組根據(jù)刺激物的濃度分為500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15.6μg/mL共6個實驗組，對照三個組，共9個實驗組，每組25個復(fù)孔，每孔加不同濃度蜂膠刺激物和對照至脾細(xì)胞培養(yǎng)板。ConA對照組每孔加入10ul ConA（終濃度20ug/ml），LPS對照組每孔加入10ul LPS（終濃度1ug/ml），空白對照組加入10ul細(xì)胞培養(yǎng)液。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。

1.2.4CCK-8檢測法將48小時培養(yǎng)物每孔分別加入10ul CCK-8溶液后繼續(xù)培養(yǎng)2小時，酶標(biāo)儀檢測OD值（波長450nm）（650nm作為參考波長進(jìn)行雙向測定），繪制細(xì)胞生長曲線，比較黑蜂膠各稀釋濃度對體外淋巴細(xì)胞增殖作用的影響。

1.2.5數(shù)據(jù)分析將所得實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0軟件分析結(jié)果，數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布則采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）進(jìn)行統(tǒng)計描述，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度新疆黑蜂膠刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖黑蜂膠各稀釋濃度組與空白對照組相比，黑蜂膠濃度為500ug/mL至62.5ug/mL時，其刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而濃度低至31.3ug/mL則與空白對照無差異（P>0.05）。所有濃度的免疫刺激活性均顯著低于ConA對照組（P<0.05）。與LPS對照相比，500ug/mL和250ug/mL的黑蜂膠表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫刺激活性（P<0.05），其余濃度均較低。

P<0.05）。

3討論

蜂膠作為天然免疫刺激劑，能強(qiáng)化免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活力，蜂膠可促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖，豐富的B細(xì)胞，可分泌特殊性抗體從而增強(qiáng)體液免疫，T細(xì)胞可強(qiáng)化機(jī)體的細(xì)胞免疫；蜂膠也可對骨髓、淋巴結(jié)等整個系統(tǒng)產(chǎn)生有益的影響。新疆黑蜂膠是集聚新疆本土特色的天然產(chǎn)品，它集聚多種生物學(xué)效應(yīng)，是一種具有廣泛開發(fā)前景的藥物，新疆黑蜂膠是種天然混合物故易溶于有機(jī)溶劑，實時蜂膠的乙醇提取法是獲取蜂膠中有效作用成分的簡便易行的方法。

蜂膠研究進(jìn)展相關(guān)文獻(xiàn)顯示蜂膠成分功效受地方差異影響，本課題組就新疆本土特色的天然產(chǎn)品黑蜂膠特異性免疫作用環(huán)節(jié)展開實驗研究。將經(jīng)過乙醇粗提的新疆黑蜂膠（1000μg/mL）按照1：2到1：64倍比稀釋后，分別與Balb/C小鼠脾淋巴細(xì)胞混合孵育48小時，應(yīng)用CCK-8試劑測定新疆黑蜂膠對小鼠脾淋巴細(xì)胞的體外激活和促進(jìn)增殖的功能，同法檢測ConA、LPS和細(xì)胞培養(yǎng)液對細(xì)胞的激活作用為本研究的對照，其中ConA為經(jīng)典的T細(xì)胞絲裂原，LPS為經(jīng)典的B細(xì)胞絲裂原，兩者均可非特異性刺激靶細(xì)胞活化與增殖。檢測結(jié)果顯示一定濃度的新疆黑蜂膠可對淋巴細(xì)胞有體外激活作用，且其免疫活性與蜂膠濃度呈明顯的正相關(guān)（r=0.853，P<0.05）。黑蜂膠各稀釋濃度組與空白對照組相比，實驗組黑蜂膠62.5μg/mL及以上濃度能顯著提高小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中蜂膠濃度在250ug/mL以上時對B淋巴細(xì)胞的激活作用甚至高于LPS（P<0.05），提示新疆黑蜂膠對小鼠脾臟T/B淋巴細(xì)胞有較明顯的體外激活和促進(jìn)增殖作用。研究結(jié)果還提示各濃度蜂膠的功能均顯著低于ConA（P<0.05），且蜂膠濃度低于31.3μg/mL時與空白對照沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。新疆黑蜂膠對淋巴細(xì)胞的激活作用存在明顯的濃度依賴性，提示在淋巴細(xì)胞上可能存在識別黑蜂膠某些化學(xué)分子的受體。

新疆黑蜂膠促小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖中T、B成分比重在本次試驗結(jié)果并未得到充分體現(xiàn)，根據(jù)免疫學(xué)相關(guān)知識，T、B細(xì)胞都有相互促進(jìn)生長分化的作用機(jī)制，而新疆黑蜂膠促小鼠淋巴細(xì)胞增殖的作用機(jī)理目前而不得而知，通過查證相關(guān)文獻(xiàn)可以了解到相關(guān)方面的信息，診谷用蜂膠給正常的小鼠經(jīng)口灌胃，觀察到蜂膠能明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)化能力。對于蜂膠藥理活性的研究多種多樣，蜂膠調(diào)節(jié)免疫功能的實驗研究的形式多樣，徐德洲等從細(xì)胞免疫.體液免疫，單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞活性，其結(jié)果反映出蜂膠具有增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力，抗體生成細(xì)胞數(shù)，增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞活性。而在龐陽康研究顯示蜂膠能提高運動小鼠外周血CD4+T細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值，而具有抵抗力竭游泳訓(xùn)練對T淋巴細(xì)胞免疫功能的抑制作用。關(guān)于蜂膠的研究最新進(jìn)展對蜂膠生物學(xué)活性還在不斷完善。本研究僅采用新疆黑蜂膠粗提制品，為了能夠更好的利用新疆資源，分離出其有效成分，明確各成分的免疫激活和調(diào)節(jié)功能的機(jī)制則需要做更加深入的研究。

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