摘要：目的 觀察Exendin-4干預(yù)對糖尿病腎?。―N）大鼠腎組織NT和HO-1蛋白和mRNA表達的影響。方法 高糖高脂飼料結(jié)合鏈脲佐菌素（40mg/kg）建立DN大鼠模型，隨機分為DN組、低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組，并與正常大鼠比較，免疫組化法觀察NT和HO-1蛋白表達的變化，RT-PCR法觀察mRNA表達的變化。結(jié)果 HO-1主要在腎小管上表達。與正常大鼠相比，DN組HO-1表達顯著降低（P<0.001）；經(jīng)Exendin-4低劑量干預(yù)和高劑量干預(yù)后HO-1表達顯著增加（P<0.001）。結(jié)論 Exendin-4通過增強HO-1表達進而降低氧化應(yīng)激以保護DN大鼠腎臟。

關(guān)鍵詞：糖尿??；腎病

2型糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）是一種慢性遺傳相關(guān)性疾病，后期常合并糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）等微血管并發(fā)癥，極大的增加了患者殘疾和死亡的風(fēng)險[1，2]。當(dāng)前認(rèn)為，DN的發(fā)病和進展是在遺傳學(xué)背景的基礎(chǔ)上，腎組織糖脂肪代謝紊亂、氧化應(yīng)激等多因素綜合作用的結(jié)果[3]。血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）由氧化應(yīng)激誘發(fā)[4]，是血紅素分解代謝過程中的限速酶，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化和抗增值等細胞保護作用[5]。課題組前期發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物Exendin-4通過降低免疫炎性反應(yīng)和延緩纖維化進程進而保護DN大鼠腎臟，而尚未闡明氧化應(yīng)激機制是否參與Exendin-4的腎臟保護作用。為此，我們建立大鼠DN模型，制備腎臟組織切片，觀察Exendin-4干預(yù)對HO-1 蛋白和mRNA表達的影響，以闡明Exendin-4保護腎臟的潛在氧化應(yīng)激機制。

1資料與方法

1.1一般資料 ♂SD大鼠40只（山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心），200～220g。鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich），Exendin-4針劑（東莞寶麗?。?。兔抗鼠HO-1多克隆抗體（北京博奧森），DAB染色試劑盒（北京博奧森），RNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)）。BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟）。

1.2方法

1.2.1 2型DN模型大鼠的構(gòu)建 30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4w，第5w結(jié)束時依大鼠體重腹腔注射鏈脲佐菌素（40mg/kg），第6w結(jié)束時測尾靜脈隨機血糖濃度（>16.65mol/l提示DM建模成功）。第10w結(jié)束時收集24尿量，測24h尿微量白蛋白含量（>30mg/（kg·d）提示DN建模成功，成功率80%）。整個建模期間，均不使用降糖藥物；并將DN大鼠隨機分為無干預(yù)組、Exendin-4低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組，每組8只。8只正常大鼠作為對照組，常規(guī)飼料喂養(yǎng)10w。

1.2.2 Exendin-4干預(yù)方法 DN建模成功后次日，低劑量干預(yù)組皮下注射4μg/（kg·d）的Exendin-4，高劑量干預(yù)組給予20μg/（kg·d）的Exendin-4，連續(xù)給藥6w。監(jiān)測體重1次/w，依據(jù)體重變化調(diào)整藥物劑量。

1.2.3留取腎組織標(biāo)本 大鼠斷頭處死，立即取出雙側(cè)腎臟。左腎置于4%的多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行免疫組化研究；右腎置于凍存管中并在超低溫冰箱中保存，行RT-PCR研究。

1.2.4 HO-1蛋白表達（免疫組化法） 石蠟切片脫蠟至水，H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗5min×3次，高壓熱修復(fù)組織抗原，山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠HO-1抗體（1：50稀釋）、4℃過夜，PBS緩沖液沖洗、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG，PBS緩沖液沖洗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染，封片保存。顯微鏡下觀察：HO-1陽性表達體現(xiàn)為細胞漿呈棕黃色或棕褐色。BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)觀察五個視野，并計算視野中陽性表達的平均灰度值。

1.2.5 HO-1mRNA表達（RT-PCR法） 剪取腎組織50mg，按照經(jīng)典法[6]依次加入Trizol（1ml）、氯仿（200μl），異丙醇（與上清液等體積）提取總RNA。按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增，反應(yīng)體系20μl，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，活化Tag酶；PCR反應(yīng)94℃15s，延伸60℃60 s，45個循環(huán)結(jié)束。引物序列由上海生工生物科技有限公司合成，β- actin：上游5'-GTC AGG TCA TCA CTA TCG GCA AT- 3'，下游5'-AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CGT- 3'，產(chǎn)物長度147bp；HO-1：上游5'-CAC GCA TAT ACC CGC TAC CT- 3'，下游5' -AAG GCG GTC TTA GCC TCT TC- 3'，產(chǎn)物長度1602bp。熒光定量PCR儀讀取CT值，利用2-ΔΔCT法進行定量分析。

1.2.6統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果以x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件作統(tǒng)計學(xué)分析，各實驗組間差異性采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果 HO-1蛋白在正常組、Exendin-4低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組腎小管均有表達，但在DN組表達較弱或幾乎不表達，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=99.2，P<0.001），見表1和圖1。

2.2 PCR結(jié)果 HO-1mRNA在正常組和Exendin-4高劑量干預(yù)組顯著表達，且二者表達量接近；在DN組表達較弱或幾乎不表達，經(jīng)Exendin-4低劑量干預(yù)后表達提升，且以Exendin-4高劑量干預(yù)后提升顯著；各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=110.8，P<0.001）。

3討論

DN是DM患者常見、重要且難治的慢性微血管并發(fā)癥，最終導(dǎo)致終末期腎病和腎衰竭[7]，從而使患者被迫選擇腎移植或者透析治療，導(dǎo)致患者生存率及生活質(zhì)量下降，同時增加家庭和社會的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

Exendin-4是從蜥蜴唾液腺分泌的多肽（由38個氨基酸縮合形成），具有增加胰島β細胞釋放胰島素、降低胰高血糖素分泌、保護心血管和腎臟的效應(yīng)。HO-1常視為誘導(dǎo)型應(yīng)激蛋白標(biāo)記物，對缺血再灌注損傷[8]和糖尿病[9]誘發(fā)的急慢性腎損傷具有保護作用。Yamagishi S[10]等發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激參與高糖環(huán)境誘發(fā)的腎臟等微血管損傷，并最終導(dǎo)致DN。為此，我們推斷降糖藥和DN治療藥可能通過降低氧化應(yīng)激水平來發(fā)揮保護腎臟的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)HO-1的蛋白和mRNA在正常大鼠腎組織中顯著表達，而在DN大鼠腎組織中不表達或輕微表達，驗證了氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的進展。在給予了Exendin-4干預(yù)后，HO-1的蛋白和mRNA表達隨著Exendin-4的劑量增加而增加，提示Exendin-4通過降低氧化應(yīng)激水平而延緩糖尿病腎病的進展，為系統(tǒng)闡明Exendin-4保護腎臟的機制奠定實驗依據(jù)。

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編輯/申磊