摘要：目的 觀察OX40/OX40L對血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖的影響。方法 原代培養(yǎng)人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞，設(shè)計OX40L小分子干擾片段，轉(zhuǎn)染VSMCs。實驗分3組：OX40LRNA干擾組（SiOX40L）、NC組和空白對照組（ Con）。將SiOX40L和NC用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染入VSMCs，提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用real-timePCR的方法檢測VSMCs中OX40L和OX40的mRNA表達(dá)，用免疫組織化學(xué)方法檢測VSMCs中的OX40L的蛋白表達(dá)，并用MTT法檢測OX40L對VSMCs增殖的影響。結(jié)果 SiOX40L組OX40L和OX40的mRNA表達(dá)顯著減少，且該組血管平滑肌細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)。結(jié)論 OX40/OX40L系統(tǒng)可能參與了VSMCs的增殖。

關(guān)鍵詞：OX40L；OX40；血管平滑肌細(xì)胞；增殖

中圖分類號：R363.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）是大血管中膜的重要組成，VSMCs增殖使血管厚度增加，當(dāng)其移行至內(nèi)膜下就成為動脈斑塊的主要成分之一，在動脈粥樣硬化早期減少血管平滑肌細(xì)胞增殖能夠延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程[1]。共刺激分子OX40L（CD134L）和OX40（CD134） 都屬于腫瘤壞死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily number 4）成員，參與了免疫、炎癥等過程，是AS的相關(guān)基因[2]。但OX40L/OX40共刺激信號是否參與了VSMCs增殖，目前尚不清楚。本研究通過培養(yǎng)原代血管平滑肌細(xì)胞，用OX40L小分子干擾片段轉(zhuǎn)染VSMCs，觀察OX40L/OX40共刺激信號對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，為早期延緩動脈粥樣進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1細(xì)胞及試劑 SiOX40L由天根生物公司合成，RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，MTT、胰蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶購自Sigma公司，LipoFectamine2000購自羅氏公司，OX40L單克隆抗體購自博奧森生物技術(shù)公司，胎牛血清購自Gibco公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2原代血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 取剖宮產(chǎn)術(shù)后的正常胎兒臍靜脈（來自寧夏國龍醫(yī)院婦產(chǎn)科），用D-Hank's液反復(fù)沖洗后剝離血管外膜及結(jié)締組織，縱向剪開血管，刮刀輕輕拭去內(nèi)膜后將血管條剪成1mm×1mm的小塊，以3～5塊/cm2密度均勻貼于培養(yǎng)甁底，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，用差速貼壁法去除其它雜細(xì)胞。約7～10d后，細(xì)胞從組織塊邊緣長出，待細(xì)胞達(dá)70%融合后，相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況，并用α-actin免疫組織化學(xué)進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定陽性后進(jìn)行后續(xù)實驗，實驗用3～6 代細(xì)胞。

1.3 SiOX40L片段轉(zhuǎn)染入血管平滑肌細(xì)胞 血管平滑肌細(xì)胞用0.125%胰酶消化約2min，離心后按1×104個/cm3密度接種到6孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)胞生長至60%～70% 融合后換用無血清培養(yǎng)液，按照LipoFectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為空白對照組、SiOX40L組和NC組，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6h后，終止轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞的RNA和蛋白，分別用real-time PCR檢測各組細(xì)胞OX40L和OX40的mRNA表達(dá)，用免疫組織化學(xué)染色檢測各組細(xì)胞OX40L的蛋白表達(dá)。

1.4 SiOX40L對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，按1×104細(xì)胞/孔接種至96孔板中，用含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)約12 h。按1.3的方法將SiOX40L轉(zhuǎn)染入血管平滑肌細(xì)胞，48 h 后每孔均加入10μl MTT（5g/L），4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 100μl，震蕩3min，于570 nm 檢測吸光值。

2結(jié)果

2.1血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 相差顯微鏡下觀察，血管平滑肌細(xì)胞在原代培養(yǎng)時第7～9d后可見細(xì)胞從貼塊邊緣爬出，呈長梭形，2～3w后，細(xì)胞沿植塊周圍呈放射狀生長。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞6h后可貼壁，細(xì)胞為長梭形，高低起伏，呈現(xiàn)VSMCs特征性的\"峰\"、\"谷\"狀生長，α-actin免疫組織化學(xué)染色陽性，見圖1。

2.2 OX40L在VSMCs中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染VSMCs 48h 后，分別提取各組染細(xì)胞的總RNA和蛋白，用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)的方法觀察OX40L的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，空白對照組和NC組OX40L的mRNA和蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。SiOX40L轉(zhuǎn)染VSMCs后，細(xì)胞OX40L的mRNA表達(dá)較空白對照組和NC組分別降低了67%和65%（P<0.01）；SiOX40L組蛋白表達(dá)比空白對照組和NC組分別降低了65%和63%（P<0.01），差異均有顯著性，見圖2。

2.3 OX40在VSMCs中的表達(dá) 空白對照組和NC組OX40的mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。SiOX40L轉(zhuǎn)染VSMCs后，細(xì)胞OX40的mRNA表達(dá)較空白對照組和NC組分別降低了44%和40%（P<0.05），差異有顯著性，見圖3。

2.4血管平滑肌細(xì)胞增殖 MTT法測定結(jié)果顯示，SiOX40L轉(zhuǎn)染VSMCs后，VSMCs活性明顯增強(qiáng)，分別比空白對照組和NC增加了64%和77%，差異有顯著性（P<0.05），而空白對照組和NC組血管平滑肌細(xì)胞增殖無明顯差異（P>0. 05），見圖4。

3討論

血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖在動脈粥樣硬化、血管術(shù)后再狹窄等心血管疾病中具有重要作用，中層平滑肌細(xì)胞的增殖在血管中膜平滑肌細(xì)胞損傷后立即發(fā)生，細(xì)胞通過內(nèi)彈力膜的網(wǎng)狀孔間隙遷移到內(nèi)膜，導(dǎo)致內(nèi)膜中VSMCs大量積聚并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)新生內(nèi)膜形成和動脈粥樣硬化[1]。

共刺激分子OX40L是參與免疫反應(yīng)的輔助性分子，屬腫瘤壞死因子超家族成員，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞表面，其受體OX40則主要由活化的T細(xì)胞表達(dá)[2]。在體內(nèi)，當(dāng)OX40L與OX40結(jié)合后，可以激活OX40信號通路，增強(qiáng)T細(xì)胞與其它細(xì)胞的粘附并傳遞抗原刺激信號，從而參與細(xì)胞的免疫活化過程，也成為治療慢性炎癥性疾病的靶標(biāo)之一[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，OX40L的表達(dá)情況與動脈粥樣硬化的狹窄程度和心肌梗死的嚴(yán)重度相關(guān)。OX40L在動脈粥樣硬化斑塊部位的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中表達(dá)顯著增多；急性冠脈綜合征患者循環(huán)血中OX40L表達(dá)顯著高于正常人[4]，提示OX40/OX40L信號通路參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，干擾OX40/OX40L共刺激信號能夠影響動脈粥樣硬化的進(jìn)程。因此，本研究對OX40/OX40L共刺激信號和血管平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OX40L可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)OX40L水平降低時，血管平滑肌細(xì)胞增殖過程明顯增強(qiáng)，且OX40L的受體OX40的表達(dá)也顯著減少。然而，OX40/OX40L共刺激信號是如何影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖及其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，還需進(jìn)一步的研究。

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編輯/申磊