摘要:地中海貧血是一組因珠蛋白肽鏈合成障礙而導(dǎo)致的遺傳性溶血性貧血,目前對(duì)地中海貧血尚無(wú)有效的治療方法。基因診斷是通過(guò)對(duì)受檢者某一特定基因(DNA)或某轉(zhuǎn)錄物(mRNA)進(jìn)行分析來(lái)診斷遺傳病的技術(shù),已成為最為普遍的地中海貧血常規(guī)檢測(cè)方法,又被稱為是診斷地中海貧血的金標(biāo)準(zhǔn)。本文綜述了地中海貧血基因診斷的研究進(jìn)展。
關(guān)鍵詞:地中海貧血;基因診斷
地中海貧血(Thalassemia)是由于血紅蛋白基因的突變導(dǎo)致珠蛋白鏈的合成不平衡所造成的一類(lèi)常見(jiàn)的單基因遺傳性、溶血性疾病。包括α地中海貧血和β地中海貧血兩種類(lèi)型,是世界上最常見(jiàn)和發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血,也是危害最嚴(yán)重的血紅蛋白病之一。目前對(duì)地中海貧血尚無(wú)有效的治療方法,因此快捷有效的診斷技術(shù)在地中海貧血干預(yù)中極為重要。隨著分子診斷學(xué)的不斷發(fā)展,特別是基因診斷技術(shù)的應(yīng)用,臨床對(duì)地中海貧血的診斷、鑒定變得簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確[1],使地中海貧血的基因診斷成為普遍的常規(guī)檢測(cè)方法。本文就有關(guān)地中海貧血基因診斷研究進(jìn)展作一綜述。
1 α地中海貧血
α地中海貧血是由于α珠蛋白基因缺失,或非缺失突變導(dǎo)致α珠蛋白鏈功能異常,或合成減少而引起的一種遺傳性溶血性疾病。目前世界上至少發(fā)現(xiàn)了35種缺失,中國(guó)人中發(fā)現(xiàn)了7種(3種α+地中海貧血和4種α0地中海貧血),最常見(jiàn)的為東南亞型(--SEA型)。少數(shù)α地中海貧血由基因突變引起,中國(guó)人最常見(jiàn)的3種為HbCS、HbQS和HbWM[2]。
1.1跨越斷裂位點(diǎn)PCR(gap-PCR) 這是最常用的針對(duì)缺失型突變的檢測(cè)方法。在α珠蛋白生成障礙性貧血中,以缺失型常見(jiàn),除了常見(jiàn)的缺失類(lèi)型外,也可能存在一些尚未發(fā)現(xiàn)的缺失型珠蛋白生成障礙性貧血,同樣都可以利用gap-PCR技術(shù)進(jìn)行分析和鑒定[3]。李友瓊等[4]運(yùn)用gap-PCR技術(shù)對(duì)1例罕見(jiàn)的巴氏水腫胎兒進(jìn)行基因分析鑒定,表明針對(duì)大片段缺失的基因型,可以通過(guò)在其上、下游設(shè)計(jì)特異引物,利用gap-PCR技術(shù)進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)論證實(shí)gap-PCR技術(shù)可以用于鑒定未知缺失突變的珠蛋白生成障礙性貧血基因型。
1.2多重PCR(multiplex-PCR,M-PCR)多重PCR是基于gap-PCR原理設(shè)計(jì)的PCR技術(shù),該技術(shù)可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)α地貧的東南亞缺失(-SEA)、右缺失(-α3.7)和左缺失(-α4.2),具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確實(shí)用而又經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),非常適合于我國(guó)以預(yù)防為主而開(kāi)展的大人群地中海貧血的分子篩查和臨床樣品的基因診斷[5]。肖奇志等[6]研究提出單管多重PCR和反向斑點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù)均能分別準(zhǔn)確檢出常見(jiàn)缺失型和非缺失型α-地貧各種突變類(lèi)型,如將兩者結(jié)合分析,還能提供相互佐證的重要信息,表明單管多重PCR結(jié)合RDB技術(shù)同時(shí)應(yīng)用于α-地貧的基因診斷,可保證產(chǎn)前診斷的可靠性。
1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime PCR)該技術(shù)原理是在PCR反應(yīng)體系中加人熒光基團(tuán),在特定的定量PCR儀上完成,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[7]。該方法具有檢測(cè)快速、通量高、操作簡(jiǎn)便、不易污染等優(yōu)點(diǎn)。彭建明等[8]通過(guò)將多重?zé)晒舛縋CR法與常用的gap -PCR法進(jìn)行比較,無(wú)論是對(duì)正常標(biāo)本還是對(duì)缺失型α地貧基因型的標(biāo)本,檢測(cè)結(jié)果都表現(xiàn)出100%的準(zhǔn)確性,研究表明此方法操作快速準(zhǔn)確,簡(jiǎn)單可行,低成本高通量,易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化,適應(yīng)大規(guī)模檢測(cè)。袁曉文等[9]采用雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光嵌套PCR技術(shù)檢測(cè)50份α地貧SEA缺失已知基因型標(biāo)本,結(jié)果顯示該方法不但能實(shí)現(xiàn)其快速分子診斷,而且能準(zhǔn)確判斷受檢標(biāo)本中的外源性污染,從而有效避免假陰性或假陽(yáng)性誤診。Fallah等[10]建立的用于檢測(cè)未知缺失類(lèi)型α-地貧的實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢測(cè)出72.4%的未知缺失類(lèi)型α-地貧,不僅可用于檢測(cè)α-珠蛋白基因的缺失,還適用于其他類(lèi)型的基因分型。
1.4多重連接探針擴(kuò)增法( multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)該技術(shù)是另外一種可選擇的用于檢測(cè)未知缺失型地中海貧血的分子診斷技術(shù)。MLPA結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù),但也有其局限性:需要精確測(cè)量DNA的濃度,樣本容易被污染;MLPA用于檢測(cè)基因的缺失或重復(fù),不適合檢測(cè)未知的點(diǎn)突變類(lèi)型[11]。Liu等[12]建立了以MLPA檢測(cè)缺失型(-SEA、-α3.7,-α4.2)及非缺失型(α-CSα、α-QSα)α-地貧的方法,其檢測(cè)的結(jié)果完全與多重PCR檢測(cè)結(jié)果相一致。陳亞軍等[13]對(duì)75份檢出α地貧表型特征樣本采用常規(guī)跨越裂點(diǎn)PCR(gap-PCR)技術(shù)及反向斑點(diǎn)雜交(RDB)法檢測(cè)α地貧基因缺失及點(diǎn)突變,采用MLPA技術(shù)檢測(cè)α珠蛋白基因缺失;產(chǎn)前診斷采用gap-PCR和MLPA法對(duì)胎兒標(biāo)本進(jìn)行α地貧基因缺失檢測(cè)。得出結(jié)論:MLPA是α地貧基因缺失常規(guī)gap-PCR檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充,可防止α地貧基因缺失的漏診及產(chǎn)前診斷中的假陽(yáng)性或假陰性誤診。
2 β地中海貧血
β地中海貧血的分子基礎(chǔ)是珠蛋白基因的點(diǎn)突變或核苷酸序列缺失,造成β珠蛋白鏈合成的減少或缺如。β珠蛋白基因突變主要分為兩大類(lèi):一類(lèi)是非缺失型突變,包括轉(zhuǎn)錄突變、RN加工突變、翻譯突變、顯性遺傳性β地中海貧血和高度不穩(wěn)定性血紅蛋白、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)突變、起始密碼子突變、非翻譯區(qū)突變、PolyA加合信號(hào)的突變。另一類(lèi)是缺失型突變。目前世界范圍內(nèi)已報(bào)道200多種β基因突變類(lèi)型,中國(guó)人中已發(fā)現(xiàn)34種,以 CD17(A→T)、CD41/42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28M(A→G)和CD71-72(+A)5種熱點(diǎn)突變最多見(jiàn),約占突變類(lèi)型的90%[14]。
2.1反向點(diǎn)雜交(reverse dot blot,RDB) 該技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外最常用的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)在于一張雜交膜上可同時(shí)篩查多種點(diǎn)突變,從而改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測(cè)一種突變的方式。尤其適合β地貧這類(lèi)突變位點(diǎn)較多的遺傳病的檢測(cè)。李敏敏等[15]應(yīng)用反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)出1種新的罕見(jiàn)β地中海貧血突變類(lèi)型,即位于β珠蛋白exonl的CD27(GCC-GAC)突變。陳碧艷等[16]用同樣的方法檢測(cè)出罕見(jiàn)β珠蛋白-86(C>G)基因,豐富了中國(guó)人β地中海貧血的突變譜。趙華等[17]將PCR-RDB方法與血紅蛋白電泳聯(lián)合,對(duì)100 例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果陽(yáng)性率為46.8%,研究證實(shí)血紅蛋白電泳聯(lián)合基因診斷可以準(zhǔn)確區(qū)分突變類(lèi)型的純合子、雜合子、雙重雜合子及正?;?,是目前診斷β-地中海貧血患者和杜絕重型地中海貧血患兒出生之有效的實(shí)驗(yàn)方法。
2.2基于實(shí)時(shí)PCR的溶解曲線分析 近年來(lái),基于實(shí)時(shí)PCR的溶解曲線分析方法檢測(cè)地貧的突變基因在臨床上受到越來(lái)越多的關(guān)注和應(yīng)用?;谠摷夹g(shù)主要有二類(lèi)方法,①基于實(shí)時(shí)PCR的熒光標(biāo)記探針溶解曲線分析(melting curve analysis,MCA),②高分辨率溶解曲線分析(high resolution melting analysis,HRM)。實(shí)時(shí)熒光PCR具有靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、特異性更強(qiáng)和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。肖奇志等[18]采用針對(duì)我國(guó)β地貧24種基因突變的四色MCA試劑盒檢測(cè)了187份臨床標(biāo)本,并與PCR-RDB進(jìn)行對(duì)照,同時(shí)以DNA測(cè)序技術(shù)作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了性能評(píng)價(jià);結(jié)果顯示診斷效率大于98%。研究還提出臨床實(shí)驗(yàn)室特別是產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室在采用RDB法檢測(cè)β地貧基因突變時(shí),很有必要同時(shí)應(yīng)用基于PMCA技術(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確證,以保證β地貧基因診斷和產(chǎn)前診斷結(jié)果的可靠性。嚴(yán)提珍等[19]也用同一方法檢測(cè)了45l份外周血樣本和84份胎兒絨毛、羊水、臍帶血產(chǎn)前診斷樣本,并與PCR-RDB進(jìn)行對(duì)照,不一致者用基因測(cè)序法驗(yàn)證,結(jié)果顯示該方法具有很好的診斷特性。廖燦等[20]對(duì)30例高風(fēng)險(xiǎn)胎兒家系進(jìn)行HRM曲線分析,然后與RDB及DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),結(jié)果完全一致,符合率為100%。研究證實(shí)基于MCA和HRM方法具有快速、簡(jiǎn)便、高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn),非常適合在臨床上廣泛開(kāi)展應(yīng)用。
2.3 DNA測(cè)序 是最直接最準(zhǔn)確的判斷突變的位置和性質(zhì)的方法,盡管費(fèi)用相對(duì)較高,仍然是檢測(cè)未知的地貧突變基因的關(guān)鍵方法。通過(guò)設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR,然后進(jìn)行測(cè)序可以確定突變的具體位置和性質(zhì)。目前,基因測(cè)序已經(jīng)在地中海貧血稀有突變患者的產(chǎn)前診斷中有所應(yīng)用,潘小英[21]等利用DNA 測(cè)序檢測(cè)出5種β-地貧稀有基因突變型,分別是beta nt1582(A>G),PolyA(AATAAA>GATAAA);CD13/14(-C);beta nt 1586(A>G),PolyA(AATAAA>AATAGA);IVS-1-1(G>T);IVS-2-2(-T),其中前2種為新發(fā)現(xiàn)的β-地貧基因突變類(lèi)型,得出結(jié)論:對(duì)常規(guī)基因檢測(cè)技術(shù)不能診斷的β-地貧疑似病例,可作DNA測(cè)序進(jìn)行確診。宋春林[22]等檢測(cè)出CD6、CD56、CD22 三種稀有β地貧突變,研究表明聯(lián)合反向點(diǎn)雜交和直接基因測(cè)序技術(shù)可為攜帶稀有β地中海貧血基因突變的夫婦提供產(chǎn)前基因診斷。葉國(guó)永[23]等聯(lián)合應(yīng)用MLPA技術(shù),PCR技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)100例臨床樣本,說(shuō)明MLPA技術(shù)與基因測(cè)序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可用于臨床常規(guī)應(yīng)用。
3結(jié)論
基因診斷是地貧診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。地中海貧血基因診斷技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展,已成為一項(xiàng)成熟的技術(shù), 無(wú)論從速度、效果、敏感度、自動(dòng)化程度、分析成本等方面,傳統(tǒng)方法是無(wú)法比擬的。目前用于地貧基因診斷的方法較多,本文只敘述了其中幾項(xiàng),這些方法各有特色和優(yōu)缺點(diǎn),不同實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和經(jīng)驗(yàn)以及對(duì)患者疾病的判斷等因素而考慮使用何種方法?;蛟\斷對(duì)操作人員和設(shè)備要求較高,應(yīng)特別注意其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。為提高地中海貧血診斷的準(zhǔn)確性,減少誤診和漏診,應(yīng)將基因診斷法和其他方法有機(jī)結(jié)合起來(lái)。相信在不久的將來(lái),地中海貧血的基因診斷技術(shù)將更加成熟、完善。
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編輯/張燕