摘要：目的 為更好地為兒童急性再生障礙性貧血體內(nèi)細胞因子濃度變化提供證據(jù)。方法 采再障組（46例）和對照組（48例）靜脈血，用酶聯(lián)免疫吸附法測定所取血樣標本中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（INF-γ）的含量。并用獨立樣本t檢驗分析兩組外周血中細胞因子是否存在顯著性差異。結(jié)果 再障組患兒外周血TNF-α和INF-γ的含量均高于對照組兒童。結(jié)論 通過對TNF-α和INF-γ的監(jiān)測，可以有效的了解再障患兒疾病進展，治療效果和預(yù)后情況。

關(guān)鍵詞：再生障礙性貧血；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ

再生障礙性貧血可分為急性再障和慢性再障兩型。其中急性再生障礙性貧血發(fā)病急、進展快，骨髓衰竭是其主要病理過程，常伴內(nèi)臟出血、嚴重感染，常危及生命，預(yù)后不良。但是現(xiàn)在大部分的病例被診斷為特發(fā)性免疫異常導(dǎo)致的再生障礙性[1]。細胞因子失調(diào)，包括腫瘤壞死因子（TNF-α），干擾素（INF-γ），今年來研究發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血的發(fā)病機制中起到了重要的作用[2]。兒童再生障礙性貧血已經(jīng)成為繼兒童白血病之后，兒童死亡率較高的一種血液系統(tǒng)疾病[3]。本研究為了給臨床上提供更好的關(guān)于兒童急性再障體內(nèi)細胞因子濃度變化的證據(jù)?，F(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1一般資料 2010年6月～2013年6月我院診治的46名急性再生障礙性貧血患兒。符合我國小兒再生障礙性貧血的診斷及分型標準[4]?；純壕鶠榧毙栽偕系K性貧血發(fā)作。其中男20例，女26例，中位年齡6.3（2～14）歲。對照組選擇同期到我院體檢中心體檢的正常兒童，共48例，男21例，女27例，中位年齡7（2～16）歲。兩組兒童的年齡比較和性別比例上無顯著性差異，P≥0.05。

1.2方法

1.2.1標本收集 用肝素鈉抗凝管采集靜脈血5ml用于TNF-α測定。取用無肝素采集管采集靜脈血15ml用于INF-γ測定。

1.2.2TNF-α含量的測定 以鼠源性的抗TNF-α單抗以每孔400ng的量，在PH值為9的碳酸-碳酸鈉緩沖液中包被96孔板中，置4℃環(huán)境過夜。取出后洗滌3次，加入預(yù)先備好的待測樣本及標準的TNF-α（制作標準曲線用）。37℃孵育2h。用洗滌液洗滌3次，加入羊抗鼠TNF-α抗體，37℃孵育2h后，再洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG，37℃孵育2h后加入底物顯色。終止顯色后在自動酶標儀上測定濃度，并以標準曲線為基準求得TNF-α的含量。以（x±s）ng/ml的形式表示結(jié)果。

1.2.3INF-γ含量測定 將上述采得的用于INF-γ測定的靜脈血在室溫凝固30m in，1000r /m in離心15m in，收集血清。檢測IFN-α用人IFN-α檢測Elisa試劑盒，操作步驟為分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。再用封板膜封板后置37℃溫育30min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。終止顯色后在自動酶標儀上測定濃度，并以標準曲線為基準求得IFN-α的含量。以（x±s）ng/ml的形式表示結(jié)果。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS1 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均x ± s表示，結(jié)果分析采用獨立樣本的t 檢驗，以P <0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α含量的對比結(jié)果 再障組患兒外周血中TNF-α含量的平均值是：（56.51±20.02） ng/ml，而對照組的患兒的平均值為（25.88±10.11）ng/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.008<0.05，差異具有顯著性。

2.2 INF-γ含量的對比結(jié)果 再障組患兒外周血中INF-γ含量的平均值是：（21.2±9.22） ng/ml，而對照組的患兒的平均值為（8.87±10.11）ng/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.001<0.05。

3 討論

近年來，越來越多的證據(jù)表明，再生障礙性貧血發(fā)病與免疫異常有關(guān)。已經(jīng)有不少學(xué)者從細胞因子水平方面研究再生障礙性貧血[5]。到目前為止雖然再生障礙性貧血精確的發(fā)病機制還沒有被完全的闡明，但是大量證據(jù)表明T細胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)異常在再障的發(fā)病機理中發(fā)揮了重要的作用。Th1功能失調(diào)被認為是再障發(fā)病的一個重要原因，Th1功能活躍導(dǎo)致TNF-α和INF-γ過表達成為了再障炎癥改變的基礎(chǔ)[6]。

腫瘤壞死因子，是單核-巨噬細胞分泌的單核細胞刺激因子，在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要的作用。人的TNF具有兩種形式TNF-α和TNF-β。由于TNF-β又稱為淋巴毒素只限于局限分泌，而TNF-α則被廣泛分泌到外周血循環(huán)中。所以在關(guān)于機體免疫功能的研究中，一般都是檢測TNF-α的含量。研究表明，再障患者體內(nèi)TNF的含量有明顯增加[7]。最初的研究認為，TNF是造血祖細胞的負調(diào)節(jié)因子，能夠抑制粒紅細胞集落形成單位、粒單細胞集落形成單位、紅系爆式集落形成單位及紅系集落形成單位的形成[8] 。但后期證實，TNF對正常造血細胞具有雙向調(diào)節(jié)作用[9]。在正常情況下，TNF-α濃度較低，適量的TNF-α對機體有保護作用，在疾病的病理改變下，TNF-α大量分泌，以致對機體產(chǎn)生損害作用。最近的研究證實，TNF升高是由于患兒存在自身免疫功能缺陷，特別是組織免疫受到抑制，過量的TNF-α刺激單核-巨噬細胞從而分泌更多的結(jié)果。是否還有其它因素影響，尚待進一步探討[10]。本研究的結(jié)果為再障兒童體內(nèi)外周血TNF-α含量顯著高于正常兒童含量提供了臨床依據(jù)。

INF-γ主要由輔助T（Th）細胞產(chǎn)生，INF-γ是可調(diào)節(jié)Th細胞極化的細胞因子 。在這種調(diào)節(jié)機制中， 細胞分泌的INF-γ 發(fā)揮著十分重要的作用，能顯著地促進Th1應(yīng)答，且抑制Th2應(yīng)答[11]。國外已經(jīng)有學(xué)者研究表明再障患者外周血中存在高水平的INF-γ[12]升高的機理可能是患兒血清中血管內(nèi)皮生長因子水平明顯低于正常患兒，也可能是由于患兒外周血T、B淋巴細胞調(diào)節(jié)紊亂，機體的免疫功能發(fā)生障礙的原因。再障患兒Th1功能活躍，超過了機體正常的調(diào)節(jié)功能，產(chǎn)生高水平的INF-γ，進而對造血又起抑制作用，進一步惡化再障。所以體內(nèi)的INF-γ含量可以有效的體現(xiàn)再生障礙性患者疾病的嚴重程度。在我們這次研究中，也可以看到急性再生障礙性貧血患兒外周血中的INF-γ的含量與對照組患兒體內(nèi)INF-γ的含量差異具有顯著性。這里后期應(yīng)該追加急性再障和慢性再障患兒體內(nèi)外周血INF-γ含量比較的研究，以提供更完善的證據(jù)證明INF-γ的含量可以反映再障疾病的嚴重程度。

綜上所述，在再生障礙貧血的發(fā)展過程中，通過對TNF-α和INF-γ三種細胞因子的監(jiān)測，可以有效地了解疾病的情況、治療效果和疾病的預(yù)后，具有較重要的意義。本研究為再障的新治療靶點提供有效的臨床依據(jù)。同時，提示我們較新的研究思路，有助于進一步研究兒童再生障礙性貧血。

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編輯/蘇小梅