摘要：目的 建立冷沉淀細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法 按《中國藥典》2010年版（二部）附錄收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法及指導(dǎo)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 冷沉淀經(jīng)過特殊方法溶解后的溶液在原倍下對(duì)鱟試劑無干擾作用。結(jié)論 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法可用于冷沉淀的熱原檢查。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素；冷沉淀；鱟試劑

根據(jù)《關(guān)于開展價(jià)撥凝血因子生產(chǎn)用冷沉淀試點(diǎn)工作的通知》[1]（國食藥監(jiān)安[2007]748號(hào)）可知，冷沉淀對(duì)緩解當(dāng)前凝血因子Ⅷ制劑市場供應(yīng)短缺局面具有不可或缺的作用，而在目前使用的冷沉淀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定冷沉淀細(xì)菌內(nèi)毒素含量≤5EU/g 。因此冷沉淀細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法的建立迫在眉睫。

1 儀器與試劑

移液器、DELTA 320型pH計(jì)、Scout Pro601F型電子天平、37℃±1℃恒溫水浴箱，無熱原吸頭、螺旋震蕩器。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，效價(jià)100EU/支，批號(hào)150601-201176，中國食品藥品檢定研究院），鱟試劑 （TAL1，靈敏度0.25EU/ml，批號(hào)1313041，湛江安度斯生物有限公司；TAL2，靈敏度 0.125EU/ml，批號(hào) 120201，廈門鱟試劑廠；TAL3，靈敏度0.06EU/ml，批號(hào)1301302，湛江安度斯生物有限公司），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)1211100，含量≤0.03EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）。

Tris緩沖液（批號(hào)，20130520，自配，采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水配置保證無熱原），配制方法：取三羥甲基氨基甲烷0.6004g溶解于裝有100ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的去熱原試劑瓶中，振蕩至完全溶解，再加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水至250ml，最后用濃度為1mol/L的鹽酸在pH計(jì)上調(diào)節(jié)pH至7.03。

冷沉淀：C-P12218-2100-1（用作干擾試驗(yàn)），C-P12220-2100-1，C-P12225-2100-1，C-P12230-2100-1

2 方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn) 按照《中國藥典》[2]2010年版二部附錄XII？E“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”規(guī)定的的方法對(duì)所使用的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。經(jīng)復(fù)核，兩種鱟試劑的的靈敏度的測定值都在0.5λ～2λ，復(fù)核規(guī)定要求見表1。

2.2冷沉淀溶解 取一定量的冷沉淀（1.0g～3.0g），按照1：9（冷沉淀質(zhì)量：Tris緩沖液體積）加入無熱原瓶中，37℃水浴，每5min震蕩一次，直到完全溶解或者30min。然后在離心機(jī)上3000r/min， 4℃，離心15min。離心完成后蓋上去熱原不銹鋼蓋即為試驗(yàn)用樣品。

2.3試驗(yàn)方法 冷沉淀溶解液細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定：L=L0/稀釋倍數(shù)，式中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定L0≤5EU/g，稀釋倍數(shù)為10倍。經(jīng)計(jì)算，因此冷沉淀溶解液細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值為：L=L0/稀釋倍數(shù)=5/10=0.5EU/ml。供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：例如選用靈敏度為0.25EU/ml鱟試劑時(shí)，MVD=L/λb=0.5/0.25=2倍。

2.4供試品干擾試驗(yàn) 干擾試驗(yàn)選擇靈敏度為0.25EU/ml，0.125 EU/ml，0.06 EU/ml鱟試劑，冷沉淀的最大有效稀釋倍數(shù)分別為2、4、8倍。按下表對(duì)各樣品進(jìn)行稀釋。

將以上的A、B、C、D溶液加入鱟試劑反應(yīng)管中垂直放入（37±1）℃水浴中，保溫（60±2）min后，取出供試品判定結(jié)果（見表3）。

結(jié)果判定：只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES和Et）

式中 Xs、Xt分別為溶液C與B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。ES在0.5λ～2λ間且Et在0.5 ES～2 ES供試品稀釋液在該稀釋倍數(shù)倍下對(duì)鱟試劑無干擾作用

代入公式計(jì)算可得TAL1： ES=λ；Et=0.87λ，TAL2 ：ES=λ；Et=λ；ES=λ；TAL3：Et=λ； ES=0.75λ干擾試驗(yàn)成立，供試品稀釋液在相對(duì)應(yīng)的最大倍稀釋下對(duì)鱟試劑無干擾。

2.5冷沉淀細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 取3批冷沉淀（批號(hào)為C-P12220-2100-1，C-P12225-2100-1，C-P12230-2100-1），用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水稀釋4倍，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)（見表4）。

由表4可見，供試品和陰性對(duì)照管均為陰性，陰性對(duì)照管和供試品陽性對(duì)照管均為陽性， 3個(gè)批號(hào)供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

考慮到冷沉淀其成分比較復(fù)雜以及來源和工藝的原因，存在干擾因素較多，故將本品稀釋4倍后，選用靈敏度為0.125 EU/m的鱟試劑時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生干擾。

本次試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法可以對(duì)冷沉淀細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1]《關(guān)于開展價(jià)撥凝血因子生產(chǎn)用冷沉淀試點(diǎn)工作的通知》（國食藥監(jiān)安[2007]748號(hào)）.

[2]中華人民共和國藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典[S].二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010版.

編輯/蘇小梅