摘要：目的 探討復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病分離株基因型與耐藥性。方法 選擇本院婦科的門診及住院RVVC患者，收集時(shí)間為2013年11月～2014年10月共計(jì)100例，平均年齡（52.2±27.9）歲，對RVVC患者致病念珠菌進(jìn)行白色念珠菌基因型分析，比較了不同白色念珠菌基因型對6種常規(guī)抗真菌藥的MIC值及耐藥性。結(jié)果 80株為單一條帶，大小為450dp，與A型標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC96113電泳條帶相同，為A型；12株為840dp，為B型克柔假絲酵母菌ATCC6258；8株為450bp和840bp，為C型近平滑假絲酵母菌ATCC22019。不含內(nèi)含子組（B型與C型）白假絲酵母菌對5-氟尿嘧啶、咪康唑、克霉素、氟康唑、伊曲康唑的MIC值與含內(nèi)含子組（A型）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組白假絲酵母菌對咪康唑及5-氟尿嘧啶的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不含內(nèi)含子組（B型與C型）更低（P<0.05）。結(jié)論 不同白假絲酵母菌基因型別在體外試驗(yàn)中對不同藥物的最低抑菌濃度和敏感率存在差異。因此，臨床醫(yī)生需重視臨床真菌的檢測，合理應(yīng)用抗真菌藥物，控制外陰陰道假絲酵母菌的重復(fù)感染。

關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。荒退幮?/p>

復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。╮ecurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC）是由假絲酵母菌病感染引起的外陰陰道炎癥，引起陰道瘙癢奇癢和外陰灼痛，是最常見的婦女外陰陰道炎癥之一[1]。RVVC中的致病菌中白念假絲酵母菌約占85～95%，光滑假絲酵母菌占5～10%，熱帶假絲酵母菌占5%[2]。隨著抗生素和抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，陰道假絲酵母菌對抗菌藥的敏感性逐漸降低，我們本次研究目的為調(diào)查復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病分離株基因型與耐藥性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇本院婦科的門診及住院RVVC患者，復(fù)發(fā)性VVC診斷符合樂杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第七版診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：1年中發(fā)作VVC≥4次，就診陰道分泌物懸滴法鏡檢陽性。收集時(shí)間為2013年11月～2014年10月共計(jì)100例，平均年齡（52.2±27.9）歲，對其行陰道分泌物的培養(yǎng)，分離念珠菌。

1.2菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會推薦的M27-A微量法測定白假絲酵母菌對6種抗真菌藥物的敏感性。ATCC標(biāo)準(zhǔn)株：白假絲酵母菌ATCC96113、克柔假絲酵母菌ATCC6258及近平滑假絲酵母菌ATCC22019。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①孕婦、糖尿病、有長期服用免疫抑制藥、抗生素及糖皮質(zhì)激素的人群；②有各種急性、慢性感染，嚴(yán)重肝、腎功能不全，惡性腫瘤，自身免疫性疾病者。

1.4 DNA提取方法 將標(biāo)本送至華星醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心。白假絲酵母菌分離株單菌落轉(zhuǎn)種至堡葡萄糖培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)36h，取標(biāo)本放入離心管，加入蒸餾水洗滌，離心沉淀，加入80μL D N S溶液（0.25%mol/L EDTA，15mmol Tris-Hcl，pH9.6）及去離子水，再離心取上清液，加入3mmol/L醋酸鈉和異丙醇，離心后去上清液，加入75%的乙醇250μL，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA含量和濃度。保存于-15℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR的擴(kuò)增針對白假絲酵母菌25S rDNA編碼區(qū)可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。特異性引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。將所有PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7抗真菌藥配置及MIC終點(diǎn)判定 咪康唑、克霉素的濃度為32～0.03μL/ml；氟康唑、制霉菌素的濃度為16～0.125μL/ml；伊曲康唑的濃度為32～0.03μL/ml；5-氟尿嘧啶的濃度為256～0.03μL/ml。敏感：5-氟尿嘧啶MIC≤0.5μg/ml，咪康唑MIC≤2μg/ml，伊曲康唑MIC≤0.25μg/ml，克霉素MIC≤1μg/ml，氟康唑MIC≤4μL/ml，制霉菌素MIC≤4μg/ml。耐藥：5-氟尿嘧啶MIC≥32μg/ml，咪康唑MIC≥8μg/ml，伊曲康唑MIC≥2μg/ml，克霉素MIC≥8μg/ml，氟康唑MIC≥32μL/ml，制霉菌素MIC≥16μg/ml。

1.6統(tǒng)計(jì)分析方法 將資料錄入SPSS13.0軟件。計(jì)量資料采用x±s描述，符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)；對計(jì)數(shù)資采用頻數(shù)描述，用χ2檢驗(yàn)法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析：將單因素分析中P<0.05的變量納入Logistic回歸分析，計(jì)算優(yōu)勢比及95%可信區(qū)間。

2結(jié)果

2.1 RVVC患者陰道白假絲酵母菌基因型分布 對RVVC患者陰道內(nèi)的白假絲酵母菌所提取的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將100株白假絲酵母菌分為3中基因型：80株為單一條帶，大小為450dp，與A型標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC96113電泳條帶相同，為A型；12株為840dp，為B型克柔假絲酵母菌ATCC6258；8株為450bp和840bp，為C型近平滑假絲酵母菌ATCC22019。

2.2不同基因型別白假絲酵母菌對六種抗真菌藥的藥敏分析 將100株白假絲酵母菌分為：含內(nèi)含子組（A型）與不含內(nèi)含子組（B型與C型）。結(jié)果顯示兩組白假絲酵母菌對5-氟尿嘧啶、咪康唑、克霉素、氟康唑、伊曲康唑的MIC值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組白假絲酵母菌對咪康唑及5-氟尿嘧啶的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3討論

外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC）是一種由念珠菌感染引起的外陰陰道皮膚點(diǎn)膜疾病，是育齡女性的常見疾病。念珠菌寄居于陰道粘膜，它與女性陰道其他定植菌如乳酸桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌等構(gòu)成陰道正常菌群，正常情況下不會引起任何不適，但當(dāng)局部菌群失調(diào)或機(jī)體免疫力低下時(shí)，就會引起相應(yīng)的陰道炎癥[4]。目前對于RVVC發(fā)病機(jī)制仍然了解較少，大多數(shù)RVVC女性無明顯誘因，約10%的RVVC患者可檢出光滑假絲酵母菌和其他假絲酵母菌[5]，由于人群體質(zhì)、營養(yǎng)狀況、生活習(xí)慣、抗真菌感染的醫(yī)療實(shí)踐和策略的不同等因素，不同國家或地區(qū)的致病念珠菌菌相組成幾率不盡相同。也有研究認(rèn)為可能是與抗真菌藥物的長期廣泛應(yīng)用以及對RVVC的長期不規(guī)范治療有關(guān)。有研究者[6]對2007年對350位VVC陰道分泌物念珠菌分析發(fā)現(xiàn)非白色念珠菌感染為25.6%。Richer等2005年對84例RVVC患者陰道分泌物的培養(yǎng)結(jié)果顯示，非白色念珠菌高達(dá)42%，而同期收集的VVC患者中該比率為20%。我國劉朝暉[7]等對108位RVVC患者陰道來源致病念珠菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，所檢出的酵母菌白色念珠菌為主（75%），非白色念珠菌的為25%，其中以光滑念珠菌占多數(shù)，達(dá)17.6%。

我們本次研究中發(fā)現(xiàn)100株白假絲酵母菌分為3中基因型：80株為單一條帶，大小為450dp，與A型標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC96113電泳條帶相同，為A型；12株為840dp，為B型克柔假絲酵母菌ATCC6258；8株為450bp和840bp，為C型近平滑假絲酵母菌ATCC22019。還研究認(rèn)為基因型與菌株的定植部位有關(guān)，定植部位的微環(huán)境對定植其中的菌株有選擇性。人體其他部位與陰道分離來源的白色念珠菌基因型分布存在明顯差異，而且正常人群與陰道炎來源的白色念珠菌基因型分布相同。A型白假絲酵母菌是明顯占優(yōu)勢的基因型。所占的比例80%（80/100），研究提示可能與其含有基因型CAI 30-45和CAI 32-46基因片段有關(guān)[8]。

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子組B、C型白假絲酵母菌的咪康唑及5-氟尿嘧啶明顯低于A型。表明上述2種抗真菌藥物對含內(nèi)含子的B、C型白假絲酵母菌的抗菌作用優(yōu)于不含內(nèi)含子的A型白假絲酵母菌，與劉朝陣等[9]的報(bào)道一致。白假絲酵母菌25S rDNA編碼區(qū)內(nèi)存在的可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子具有自我剪接功能，這種功能可被堿基類似物抑制，因此，含有此內(nèi)含子的白假絲酵母菌對5-氟胞嘧啶更敏感。Richter等[10]對429例VVC（其中84例為RVVC）患者陰道分泌物分離培養(yǎng)出的酵母菌進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3.3%的白假絲酵母菌對氟胞嘧啶耐藥；15.2%的光滑假絲酵母菌對氟康唑（FLZ）耐藥，74.1%對伊曲康唑（itraconazole，ITZ）耐藥；3.3%的近平滑假絲酵母菌對ITZ耐藥；41.7%的克柔假絲酵母菌對FLZ耐藥，58.3%對ITZ耐藥，8.3%對氟胞嘧啶耐藥；55.6%的乳酒假絲酵母菌對ITZ耐藥；12.5%的熱帶假絲酵母菌對氟胞嘧啶耐藥。Sobel等[11]對白假絲酵母菌進(jìn)行藥敏檢測，96.0%對FLZ敏感，0.4%對FLZ劑量依賴敏感，3.6%對FLZ耐藥。對光滑假絲酵母菌進(jìn)行藥敏檢測，4.5%對FLZ耐藥。

也有研究指出ERG11（也稱ERG16或CYP51A1）基因是唑類藥物作用的靶酶編碼基因。ERG11基因大小為1 851 bp，起始密碼子是位于第148～150 bp的ATG，終止密碼子是位于1 732～1 734 bp的TAA。ERG11基因過度表達(dá)和基因突變與耐藥相關(guān)的原因可能是：ERG11基因過度表達(dá)，14-DM大量生成，導(dǎo)致菌株對FLZMIC增加，對FLZ產(chǎn)生耐藥，但目前研究發(fā)現(xiàn)的基因過度表達(dá)并非單獨(dú)出現(xiàn)，往往與點(diǎn)突變、基因調(diào)節(jié)外排泵的過度表達(dá)等其他改變一同出現(xiàn)。18S rDNA，26S rDNA D1/D2區(qū)、ITS區(qū)也與RVVC的耐藥有關(guān)。

本研究通過對RVVC患者致病念珠菌進(jìn)行白色念珠菌基因型分析，比較了不同白色念珠菌基因型在RVVC患者中6種常規(guī)抗真菌藥的MIC值及耐藥性，不同白假絲酵母菌基因型別在體外試驗(yàn)中對不同藥物的最低抑菌濃度和敏感率存在差異因此，臨床醫(yī)生需重視臨床真菌的檢測，合理應(yīng)用抗真菌藥物，控制外陰陰道假絲酵母菌的重復(fù)感染，保障婦女身心健康，提高婦女工作效率和生活質(zhì)量。

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編輯/許言