摘要：目的 為明確EC-SOD在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用，課題組體外構(gòu)建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表達(dá)載體，并觀察其在THP-1單核源性巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法 重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切以及序列分析正確無誤后，借助Lipofectamine 2000將轉(zhuǎn)染到THP-1單核源性巨噬細(xì)胞中，24h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、PCR和測(cè)序分析后，證實(shí)pCDNA 3.1/EC-SOD質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pCDNA 3.1/EC-SOD通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入THP-1單核源性巨噬細(xì)胞后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。結(jié)論 pCDNA 3.1/EC-SOD載體構(gòu)建成功，并成功在THP-1單核源性巨噬細(xì)胞中表達(dá)，為研究EC-SOD在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：EC-SOD；THP-1單核源性巨噬細(xì)胞

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，是體內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)，包括銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重視的細(xì)胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。EC-SOD是Marklund等在1982年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型糖蛋白，主要由巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，它是惟一分布在細(xì)胞外發(fā)揮抗氧化作用的酶，對(duì)機(jī)體的氧化/抗氧化平衡起至關(guān)重要的作用[2，3]。EC-SOD可以清除脂質(zhì)過氧化物、減輕氧自由基對(duì)組織細(xì)胞的過氧化損傷，并能降低脂質(zhì)過氧化物形成，從而保護(hù)血管內(nèi)皮免受氧自由基的損傷，防止動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）的形成[4，5]。為了更深層次的研究EC-SOD的作用機(jī)理，我們構(gòu)建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)染了THP-1單核源性巨噬細(xì)胞，為進(jìn)一步研究EC-SOD的作用奠定了基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 大腸桿菌DH5α（北京博邁德生物技術(shù)有限公司）；PcDNA-3.1（+）質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA 相對(duì)分子質(zhì)量maker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA 連 接 酶（Fermentas公司）；Taq DNA 聚合酶、dNTP （Takara公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA純化回收試劑盒（Axygen公司）。HF160W CO2孵箱（上海力申科學(xué)儀器技術(shù)公司）；CKX31相差顯微鏡 （OLYPUS公司）；721-型分光光度計(jì)（惠普上海分析儀器有限公司產(chǎn)品）。RPMI-1640培養(yǎng)基 （GIBCO.BKI公司）；高速低溫離心機(jī) （艾本德公司）；Universal HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)和酶標(biāo)儀680 （Bio-Rad公司）；實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀FTC-3000 （Funglyn Biotech公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；佛波酯（phorbol myristate acetate， PMA）、同型半胱氨酸、MTT、二甲基亞楓DMSO （Sigma公司）； Trizol（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光PCR試劑盒（Fermentas公司），引物由上海生工公司合成。

1.2方法

1.2.1 THP-1單核源性巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) THP-1單核細(xì)胞加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以2×106個(gè)/ L接種于培養(yǎng)瓶中，加入濃度為500 μmol/ L的PMA后培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)和分化情況，證實(shí)THP-1單核細(xì)胞是否分化為巨噬細(xì)胞。

1.2.2 EC-SOD基因的PCR擴(kuò)增 收集培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，以提取總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，以cDNA為模板擴(kuò)增EC-SOD基因編碼區(qū)域序列，上游引物：5'-CCCAAGCTTATGCTGGCGCTACTG TGTTC-3' （劃線處為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CGGAATTCTCAGGCGGC CTTGCACTCG-3' （劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），產(chǎn)物大小為718bp。反應(yīng)體系如下：GC Buffer 12.5 L，cDNA 1 L，dNTP 4 L， Taq DNA 聚合酶0.25 L，游引物各0.5 L，6.25 L H2O。PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸30s， 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 pCDNA 3.1/EC-SOD重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物電泳后回收目的片段。載體質(zhì)粒pCDNA -3.1和目的片段分別酶切.酶切后回收產(chǎn)物，按照如下連接反應(yīng)體系進(jìn)行連接，：T4 DNA 連 接 酶2L，pCDNA 3.1載體質(zhì)粒2L，目的片段8L，3L Buffer，H2O 5 L。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α細(xì)胞，接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4重組質(zhì)粒的篩選鑒定 從轉(zhuǎn)化克隆中挑取單個(gè)均勻菌落行PCR鑒定，將陽性的菌落接種LB培養(yǎng)基中搖菌過夜。提取重組質(zhì)粒，并行雙酶切鑒定。將陽性的重組細(xì)菌，進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.2.5脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染THP-1單核源性巨噬細(xì)胞 將巨噬細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞，加入1 mL無血清無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基。按質(zhì)粒DNA（g）與LipofectamineTM 2000（L）1：2的比例，將DNA于500 L無血清培養(yǎng)基中稀釋；LipofectamineTM 2000使用前輕輕混勻，取適量稀釋在500 L無血清培養(yǎng)基中并與稀釋的質(zhì)粒DNA混合后將混合物加到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換用10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用熒光顯微鏡觀察重組載體在細(xì)胞中的表達(dá)情況，收集細(xì)胞作進(jìn)一步分析。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序分析 陽性克隆經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切后得和兩個(gè)片段，符合預(yù)計(jì)結(jié)果（見圖2）。測(cè)序分析結(jié)果與Genebank 上述 ECSOD mRNA序列（NM_003102.2 ）比對(duì)分析表明，核苷酸序列的同源性為99.99%，有一處位點(diǎn)的堿基序列發(fā)生了變化， 氨基酸序列同源性為100%，屬無義突變，DNA 測(cè)序峰值均勻一致（見圖2），說明擴(kuò)增到的EC-SOD是正確的。

2.2重組質(zhì)粒pCDNA 3.1/EC-SOD轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞 將重組質(zhì)粒pCDNA 3.1/EC-SOD轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察到巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)大量的綠色熒光蛋白（見圖3）。

2.3重組pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬細(xì)胞中的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pCDNA 3.1/EC-SOD轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞后分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢驗(yàn)EC-SOD的表達(dá)。如圖4A所示：分別與對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比pCDNA 3.1/EC-SOD組中EC-SOD mRNA的表達(dá)分別升高1.72倍和1.91倍（P<0.01）；同時(shí)，EC-SOD的蛋白表達(dá)在重組質(zhì)粒組中分別升高了1.68倍和1.87倍（P<0.01）。

A：重組pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬細(xì)胞中mRNA的表達(dá)； B： 重組pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。**P<0.01，與對(duì)照組相比；△P<0.05，與空質(zhì)粒組相比。

3討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，心腦血管疾病的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)排在各種疾病之首。其中，動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）及其并發(fā)癥在心腦血管疾病中占了相當(dāng)大一部分，由AS導(dǎo)致的心肌梗死、腦梗死以及冠心病等心腦血管疾病，在目前人類病死原因中居首位。因此，關(guān)于AS發(fā)病機(jī)制的研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究焦點(diǎn)?；w在正常情況下處于氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)在某些因素的刺激下會(huì)打破這種平衡，發(fā)生氧自由基產(chǎn)生與清除間的失衡，導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）蓄積，引起蛋白發(fā)生氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能紊亂，從而發(fā)生氧化應(yīng)激[6]。氧化應(yīng)激主要通過誘導(dǎo)血管炎癥基因表達(dá)的改變、啟動(dòng)過氧化作用、加速炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖等途徑參與調(diào)控了AS的進(jìn)展[7]。

若細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生大于清除，或外源性氧化物質(zhì)攝入過量時(shí)，機(jī)體會(huì)加速氧化物質(zhì)的清除，而防御系統(tǒng)來抵抗氧自由基造成的損傷。其中細(xì)胞外超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可以通過催化超氧陰離子自由基而產(chǎn)生歧化反應(yīng)，而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基的攻擊和損害。EC-SOD是唯一分布于細(xì)胞外并發(fā)揮抗氧化功能的酶，主要由巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞分泌，是血管壁中酶的重要來源[8]。在細(xì)胞外，EC-SOD可以與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素結(jié)合，催化超氧陰離子自由基（O2-·）歧化生成過氧化氫（H2O2），H2O2進(jìn)一步生成水，從而清除O2-·，以保護(hù)組織和細(xì)胞免受自由基的損傷，參與阻止AS的形成。

近年來，大量臨床和流行病學(xué)資料及循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明[9，10]，高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）可通過增加自由基的生成，引起脂質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷；促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖；誘發(fā)胰島素抵抗；并進(jìn)一步誘發(fā)AS的發(fā)生發(fā)展，是繼高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙、肥胖等因素后AS的又一獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy）是一種含硫氨基酸，在體內(nèi)主要通過甲硫氨酸循環(huán)和轉(zhuǎn)硫途徑代謝，而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本文中成功在體外構(gòu)建EC-SOD的重組載體并利用liposuction 2000TM轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞且成功表達(dá)。

在AS進(jìn)展過程中，EC-SOD作為唯一在細(xì)胞外發(fā)揮抗氧化作用的酶，其所保護(hù)作用及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。EC-SOD發(fā)現(xiàn)之初，其功能和作用并未受到大家足夠的重視和關(guān)注。EC-SOD在抵抗氧化物誘導(dǎo)的組織損傷方面發(fā)揮著非常重要的作用，因此，深入研究其作用機(jī)制將為提高機(jī)體抗氧化能力和重建自由基平衡提供新的治療靶點(diǎn)，同時(shí)也為預(yù)防和治療心腦血管疾病開拓了新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]Molina-Rueda JJ， Tsai CJ， Kirby EG.， et al. The Populus Superoxide Dismutase Gene Family and Its Responses to Drought Stress in Transgenic Poplar Overexpressing a Pine Cytosolic Glutamine Synthetase （GS1a）[J].PLoS One，2013，8 （2）：56421.

[2]Marklund SL.Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79（24）：7634-7638.

[3]Oury TD，Day BJ，Crapo JD.Extracellular superoxide dismutase in vessels and airways of humans and baboons[J].Free Radic Biol Med，1996，20：957-965.

[4]張慶軍，劉德培，梁植權(quán).動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85（6）：428-431.

[5]Chanvorachote P，Chunhacha P.Caveolin-1 Regulates Endothelial Adhesion of Lung Cancer Cells via Reactive Oxygen Species-Dependent Mechanism[J].PLoS One，2013，8（2）： e57466.

[6]Selek S， Savas HA， Gergerlioglu HS， etal. The course of nitric oxide and superoxide dismutase during treatment of bipolar depressive episode[J].J Affect Disord，2008，107（1-3）：89-94.

[7]Vesentini N， Kusmic C， Battaglia D， et al. Modulation of erythrocyte sensitivity to oxidative stress by transient hyperhomocysteinemia in healthy subjects and in patients with coronary artery disease[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2008，18（6）：402-407.

[8]Lawrence de Koning AB， Werstuck GH， Zhou J， et al. Hyperhomocysteinemia and its role in the development of atherosclerosis[J].Clin Biochem，2003，36（6）：431-441.

[9]Sobczak AJ.The effects of tobacco smoke on the homocysteine level--a risk factor of atherosclerosis[J].Addict Biol，2003，8（2）：147-158.

[10]Enneman AW，van der Velde N，de Jonge R，et al.The association between plasma homocysteine levels， methylation capacity and incident osteoporotic fractures[J].Bone，2012，50 （6）：1401-1405.

編輯/申磊