[摘 要]根據(jù)高壓液相色譜（HPLC）分離基本原理以及分子結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)物在反相色譜柱的保留時(shí)間與其正辛醇-水分配系數(shù)（Kow）直接的對(duì)數(shù)線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系，可以設(shè)計(jì)一套液相色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案。與傳統(tǒng)的HPLC教學(xué)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)不同，本方案重點(diǎn)在于讓學(xué)習(xí)者從本質(zhì)上掌握液相色譜分離的基本原理和有機(jī)物的保留規(guī)律。

[關(guān)鍵詞]高壓液相色譜（HPLC） 正辛醇-水分配系數(shù)（Kow） 相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

[中圖分類(lèi)號(hào)] G642.423 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-3437（2014）17-0160-03

液相色譜分析是儀器分析的重要手段之一，在現(xiàn)代有機(jī)物分析中發(fā)揮了巨大的作用。液相色譜分析教學(xué)也成為大學(xué)化學(xué)、生物、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)等諸多專(zhuān)業(yè)的《儀器分析》課程中的重要內(nèi)容。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各普通高校相關(guān)專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)條件得到改善，在《儀器分析》配套實(shí)驗(yàn)課程中逐步開(kāi)設(shè)了高壓液相色譜（HPLC）實(shí)驗(yàn)，有的甚至在專(zhuān)門(mén)的《色譜》課程配套實(shí)驗(yàn)中分不同類(lèi)型、目的多方案開(kāi)設(shè)實(shí)驗(yàn)。傳統(tǒng)的HPLC教學(xué)實(shí)驗(yàn)常常選擇一種到三種有機(jī)物作為對(duì)象，在一定色譜條件下進(jìn)行色譜分離與定性定量檢測(cè)，評(píng)估分離與分析的性能。然而，多年的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)讓我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)問(wèn)題，學(xué)習(xí)過(guò)的學(xué)生甚至高年級(jí)的研究生并不能初步判斷不同有機(jī)物在反相HPLC上的保留特性的差異，而且往往對(duì)色譜分離原理在HPLC的實(shí)現(xiàn)機(jī)制缺少應(yīng)有的基本認(rèn)知。這促使我們?cè)O(shè)計(jì)了一套新的液相色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)，即雙酚類(lèi)有機(jī)物的Kow測(cè)定。

一、實(shí)驗(yàn)原理

色譜法是一種借助色譜分離原理而使混合物中各組分分離的技術(shù)，它是混合物非常有效的分離、分析方法。其中的一相固定不動(dòng)，稱(chēng)為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)此固定相的流體（氣體或液體），稱(chēng)為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。圖1給出了HPLC的基本組成與結(jié)構(gòu)。

①流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶；②溶劑脫氣機(jī)；③梯度閥；④混合器；⑤高壓泵；⑥六通閥；⑦定量環(huán)；⑧保護(hù)??；⑨色譜柱；⑩紫外檢測(cè)器；{11}數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；{12}廢液收集瓶。[1]

待測(cè)有機(jī)組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過(guò)程叫做分配過(guò)程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g / mL）比，稱(chēng)為分配系數(shù)，用K表示，即：

分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。常用的分配系數(shù)是正辛醇-水分配系數(shù)Kow，即：

式中：CO、CW分別為有機(jī)物在正辛醇相和水相中的平衡濃度。Kow不同，保留時(shí)間亦不同?，F(xiàn)已積累了大量有機(jī)化合物的Kow值，是量化表征有機(jī)化合物疏水性的方法之一。[2]

USEPA根據(jù)Kow與色譜保留時(shí)間t的對(duì)數(shù)線(xiàn)性相關(guān)性[如方程（3）所示]，建立了基于反相HPLC保留時(shí)間t測(cè)定有機(jī)物Kow的標(biāo)準(zhǔn)方法。[3]

log Kow= a log t + b （3）

該標(biāo)準(zhǔn)方法中高效液相色譜法采用C-18反相色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水混合液。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定雙酚類(lèi)一系列結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)化合物的保留時(shí)間，通過(guò)考察保留時(shí)間與Kow之間的關(guān)系來(lái)進(jìn)一步理解色譜法的原理，掌握基本實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析方法。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇的系列有機(jī)物是雙酚類(lèi)有機(jī)物，包括七種，其結(jié)構(gòu)與名稱(chēng)如圖2所示。

二、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

雙酚類(lèi)有機(jī)物BPA、TDP、BPAP、BPCH、BPP、TMBPA、BPC的稀溶液；高效液相色譜儀：安捷倫1200（低壓四元梯度HPLC系統(tǒng)的組成見(jiàn)圖1），壓力：200kg / cm2；流速：1.0mL / min；二極管陣列紫外檢測(cè)器；色譜柱：Kromasil 100-5C18，150×4.6mm。流動(dòng)相甲醇-水混合液（80%甲醇∶20%水），20微升定量環(huán)。也可采用手動(dòng)進(jìn)樣模式的HPLC。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.按體積比配制80%的甲醇溶液，超聲20min除去溶液中溶解的氣體，用微孔濾膜過(guò)濾后即可作為流動(dòng)相使用。

2.打開(kāi)高效液相色譜儀，設(shè)置儀器參數(shù)：流速=1mL / min；檢測(cè)波長(zhǎng)λ=280nm；在工作站中設(shè)置樣品的相關(guān)參數(shù)：樣品名稱(chēng)、檢測(cè)時(shí)間、文件指定的保存目錄等。參數(shù)設(shè)好以后開(kāi)泵脫氣（每次更換新的流動(dòng)相都要進(jìn)行脫氣操作），脫氣完畢后測(cè)試基線(xiàn)。

3.待基線(xiàn)平穩(wěn)以后，將配好的BPA等一系列雙酚類(lèi)有機(jī)物的稀溶液用進(jìn)樣針從進(jìn)樣口依次進(jìn)樣，設(shè)定每一次的檢測(cè)時(shí)間為10min，記錄各樣品的出峰時(shí)間t，單位min。

4.樣品測(cè)定完后，關(guān)閉紫外檢測(cè)器。用超純水進(jìn)樣，清洗進(jìn)樣器中殘留的樣品，用100%甲醇流動(dòng)相沖洗色譜柱約30min，關(guān)閉高壓泵。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

在表1中記錄七種雙酚類(lèi)有機(jī)物在HPLC上的保留時(shí)間t，同時(shí)查閱現(xiàn)有的化學(xué)物質(zhì)安全手冊(cè)（MSDS）或其他工具書(shū)，或者利用Chemiffice軟件獲得這些雙酚類(lèi)有機(jī)物的Kow，計(jì)算其對(duì)數(shù)，列于表1。

注：t為用液譜法測(cè)得的相應(yīng)物質(zhì)的保留時(shí)間；Kow由Chemoffice軟件獲得。

（二）確定log t與log Kow的關(guān)系

利用Origin軟件（或者其他科學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件）作log t-log Kow圖像，并進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到結(jié)果如圖3所示。

圖3得到方程為logKow=7.521×logt+1.06651，R2=0.89608。不難看出雙酚類(lèi)有機(jī)物完全滿(mǎn)足Kow與保留時(shí)間t之間的對(duì)數(shù)線(xiàn)性關(guān)系，能夠很好說(shuō)明當(dāng)有機(jī)物Kow加大時(shí)，其HPLC保留時(shí)間t延長(zhǎng)的基本規(guī)律，而這一規(guī)律很好的反映了色譜分離原理在HPLC的實(shí)現(xiàn)機(jī)制，即有機(jī)物在流動(dòng)相與固定相中不斷分配，達(dá)到平衡。而這個(gè)LC的分配原理與Kow的分配原理是一致的。在LC中固定相是C18，相當(dāng)于Kow中作為有機(jī)相的正辛醇；而流動(dòng)相是甲醇-水混合液，相當(dāng)于是Kow中的水相。

（三）思考與討論

由圖3可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果舉例中回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.89608，明顯大于臨界相關(guān)系數(shù)（R2=0.764，a< 0.01，n=7），說(shuō)明具有顯著相關(guān)性。但是相對(duì)而言，BPA和BPC的數(shù)據(jù)相關(guān)性最差。這可能是由于下列原因引起的：（1）實(shí)驗(yàn)由本組所有成員分別進(jìn)樣，可能是由實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)者的操作習(xí)慣或操作失誤所造成的；（2）液相色譜的手動(dòng)進(jìn)樣器松動(dòng)，在換新的進(jìn)樣器前所得到的數(shù)據(jù)可能并不準(zhǔn)確；（3）由于實(shí)驗(yàn)中BPA等物質(zhì)的濃度沒(méi)有控制，濃度過(guò)高的有機(jī)物對(duì)色譜峰展寬，給其保留時(shí)間t測(cè)定帶來(lái)較大誤差。

五、結(jié)論

通過(guò)近年的教學(xué)實(shí)踐，該實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案取得了良好效果，既幫助學(xué)習(xí)者生動(dòng)快速地理解掌握HPLC的分離原理與實(shí)現(xiàn)方式，又讓他們能夠延伸知識(shí)點(diǎn)，掌握分配的重要基礎(chǔ)和參數(shù)，以及判斷有機(jī)物的保留時(shí)間，利用MSDS數(shù)據(jù)和操作Chemoffice軟件等本領(lǐng)。另外，本設(shè)計(jì)對(duì)儀器條件要求較低，有利于在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)展，既適于化學(xué)專(zhuān)業(yè)作為色譜實(shí)驗(yàn)系列教學(xué)內(nèi)容的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，又適于非化學(xué)專(zhuān)業(yè)（尤其是生物、環(huán)境、食品科學(xué)專(zhuān)業(yè)）將其作為基本實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容加以應(yīng)用。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1] http：//chemwiki.ucdavis.edu / Wikitexts / UC_Davis / UCD_

Chem_115_Lab_Manual / Lab_2%3A_High_Performance_

Liquid_Chromatography.

[2] 鄧南圣，吳峰.環(huán)境化學(xué)教程（第二版）[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，2006.

[3] USEPA.Standard Test Method for Partition Coefficient（N-Octanol / Water） Estimation by Liquid Chromatography.E1147-92，1997.

[責(zé)任編輯：羅 艷]