摘要[目的]研究殺蟲劑對(duì)松墨天牛延伸因子2（MaEF2）的影響，為深入研究MaEF2的功能、利用延伸因子基因靶標(biāo)有效防治松墨天牛提供參考。[方法]從松墨天牛文庫(kù)中分離得到EF2cDNA序列，利用RTqPCR技術(shù)測(cè)定了11種殺蟲劑脅迫后MaEF2的相對(duì)表達(dá)量。[結(jié)果]得到的MaEF2基因的部分序列，長(zhǎng)度為1 184 bp，編碼287個(gè)氨基酸；與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和家蠶（Bombyx mori）氨基酸相似性分別為92% 和93%。RTqPCR測(cè)定結(jié)果表明，殺蟲劑作用下MaEF2均上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量為對(duì)照的1.28～11.59倍。[結(jié)論]啶蟲脒的相對(duì)表達(dá)量最高，毒死蜱和噻蟲啉的表達(dá)量最低，這可能表明松墨天牛產(chǎn)生了自我保護(hù)反應(yīng)。

關(guān)鍵詞松墨天牛；殺蟲劑；延伸因子2；RTqPCR

中圖分類號(hào)S763.38文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）24-08112-04

The Expression of the Elongation Factor 2 Gene from Monochamus alternatus in Response to 11 Kinds of Insecticide

LUO Linlin， LIN Tong（College of Forestry， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510225）

Abstract [Objective] This study provides molecular data for the influence of insecticides on M. alternatus EF2， and the reference for the further research on the functions of M. alternatus EF2 which can be a target against M. alternatus. [Method] A partial cDNA sequence of elongation factor 2 gene from M. alternatus library was isolated and named MaEF2， and the relative expression of MaEF2 in response to 11 kinds of insecticides was determined by RTqPCR. [Result] The results showed that MaEF2 is 1184bp in length which has 92% and 93% amino acid similarity with the EF2 of Drosophila melanogaster and Bombyx mori， respectively.MaEF2 were up regulated under pesticides stress， and the expression level was changed from 1.28 times to 11.59 times as that as the control. [Conclusion] The expression of acetamiprid was the highest， the expression of thiacloprid and chlorpyrifos was the lowest， all of which showed that M. alternatus produced a selfprotective reaction to the insecticides.

Key words Monochamus alternatus Hope； Pesticides； EF2； Real time quantitative PCR

延伸因子（elongation factor，EF）是參與蛋白合成過(guò)程中肽鏈延伸的蛋白因子，在所有多細(xì)胞生物體的新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，它包括延伸因子 EF1 和延伸因子 EF2[1-3]。延伸因子 EF1 由 α、β、γ 和 δ 4個(gè)亞基組成，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在且大量表達(dá)的多聚核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達(dá)和翻譯過(guò)程中起重要作用[4]。EF2 是真核生物蛋白質(zhì)合成時(shí)肽鏈延伸過(guò)程中必不可少的蛋白因子[5]，它能催化GTP 水解，使肽酰-tRNA 從核糖體的氨?；稽c(diǎn)（aminoacyl site，A-site）移到肽基位點(diǎn)（peptidyl site，Psite），從而使核糖體沿著 mRNA 運(yùn)動(dòng)以完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程[6]。因此，EF2 的正常表達(dá)關(guān)系到機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)的合成。EF2 通過(guò)不斷改變其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量，以調(diào)節(jié)總蛋白質(zhì)的合成[7]，同時(shí)，在不同機(jī)制作用下，EF2 的活性和表達(dá)量也會(huì)發(fā)生改變[8]。研究表明在甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中，水體環(huán)境中的應(yīng)激因素（pH、重金屬等）可以引起廣泛的細(xì)胞損傷，包括 DNA 損害、脂質(zhì)過(guò)氧化作用以及蛋白質(zhì)氧化等[9]，最終導(dǎo)致 EF2 的表達(dá)量發(fā)生變化。

松墨天牛（Monochamus alternatus）是為害馬尾松（Pinus massoniana）等林木的重大森林害蟲，成蟲又是松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）的主要傳播媒介，因其為害嚴(yán)重且防治困難已被世界上許多國(guó)家列入檢疫對(duì)象[10]。

筆者首次克隆了松墨天牛延伸因子 EF2 基因并分析該基因在11種殺蟲劑作用后的相對(duì)表達(dá)含量，旨在了解松墨天牛延伸因子 EF2基因的結(jié)構(gòu)以及該基因在不同類型殺蟲劑作用下的反應(yīng)，為今后進(jìn)一步研究松墨天牛 EF2 的功能和與殺蟲劑之間的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx松墨天牛幼蟲采自從化馬尾松次生林，室內(nèi)配置人工飼料，在人工氣候箱中培養(yǎng)，設(shè)置環(huán)境條件為：25 ℃，相對(duì)濕度70%～75%，黑暗條件，飼養(yǎng)至蛻變?yōu)槌上x[11]。

1.2主要試劑Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA生物有限公司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1kp DNA Ladder購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3基因克隆和序列比對(duì)構(gòu)建了松墨天牛cDNA文庫(kù)，從中分離得到松墨天牛EF2基因。用GenBank的BLASTN和BLASTP在線工具進(jìn)行松墨天牛EF2及其他昆蟲EF2核酸序列的相似性分析；用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.4殺蟲劑處理用6種化學(xué)殺蟲劑和5種微生物殺蟲劑處理松墨天牛成蟲，殺蟲劑信息見(jiàn)表1。每種處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭試蟲，受藥12 h后用液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5總RNA提取與cDNA合成用Trizol總RNA抽提試劑盒提取殺蟲劑處理后松墨天?？俁NA，純化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用微量紫外分光光度儀 （Nanodrop 2000） 檢測(cè)其濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser說(shuō)明書，獲得第一鏈cDNA，作為RTqPCR的反應(yīng)模板，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6RTqPCR檢測(cè)以EF2在成蟲（未經(jīng)藥劑處理）中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，以微管蛋白（βactin）基因?yàn)閮?nèi)參基因，無(wú)菌超純水為陰性對(duì)照，采用RTqPCR（SYBR Green）檢測(cè)MaEF2在殺蟲劑脅迫后的相對(duì)表達(dá)量。RTqPCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR儀為羅氏LC480，設(shè)cDNA樣品3次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的 Ct值，利用 2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[12]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年1.7數(shù)據(jù)分析采用DPS軟件中的Duncan方法對(duì)RTPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性方差分析。

表1農(nóng)藥規(guī)格及稀釋濃度

藥劑名稱生產(chǎn)廠家稀釋倍數(shù)處理方法5%啶蟲脒乳油佛山市大興生物化工公司900倍液噴霧18%殺蟲雙水劑中山凱中公司700倍液噴霧2.5%敵殺死拜耳作物科學(xué)公司4 000倍液噴霧24%滅多威可溶性液劑江門市大光明農(nóng)化新會(huì)公司240倍液噴霧48%毒死蜱乳油江蘇蘇州佳輝化工公司1 600倍液噴霧5% 氯氰菊酯乳油鄒平縣綠大藥業(yè)公司1 500倍液噴霧40%噻蟲啉懸浮劑利民化工股份公司2 000倍液噴霧0.3%印楝素乳油海南利特蒙生物農(nóng)藥公司800倍液噴霧100億活芽孢/ml BT懸浮劑太原高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)西芮生物公司200倍液口腔注射200億活孢子/g綠僵菌粉劑廈門多多生物公司1×108個(gè)/ul浸泡10 s400億個(gè)孢子/g白僵菌粉劑江西天人生態(tài)公司1×108個(gè)/ul浸泡10 s對(duì)照-清水噴霧

2結(jié)果與分析

2.1MaEF2 序列從松墨天牛基因文庫(kù)中獲得EF2 基因的 cDNA，長(zhǎng)度為1 184 bp，編碼287個(gè)氨基酸，命名為MaEF2，核苷酸序3小結(jié)與討論

真核生物的延伸因子2是一種質(zhì)量為100 000 Da的單體多肽，通過(guò)催化依賴于GTP水解的轉(zhuǎn)位反應(yīng)將A位生成的肽基-tRNA轉(zhuǎn)移到P位，原來(lái)P位上空載的tRNA被逐出核糖體，同時(shí)，核糖體沿著mRNA向前移動(dòng)一個(gè)密碼子[6，13]。目前，已分離獲得果蠅、老鼠和倉(cāng)鼠、甲烷球菌以及小球藻等真核生物的EF2基因[14]，松墨天牛EF2的克隆是首次報(bào)道。

EF2 蛋白的主要結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程中非常保守，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTN、BLASTX比對(duì)表明，推導(dǎo)的 MaEF2 氨基酸序列與其他已知昆蟲 EF2 氨基酸序列有 84%～94%的同源性。筆者克隆出的MaEF2基因長(zhǎng)度為1 184 bp，編碼287個(gè)氨基酸，但根據(jù)其他昆蟲EF2基因全長(zhǎng)序列分析，獲得的MaEF2可能只是EF2基因全長(zhǎng)的部分序列，還缺少3’端約1 kbp的氨基酸序列，但這不影響分析該基因的表達(dá)。后期，將進(jìn)行MaEF2全長(zhǎng)基因的克隆，以深入了解松墨天牛EF2的結(jié)構(gòu)和功能。

該研究檢測(cè)了經(jīng)殺蟲劑脅迫后，EF2 mRNA在松墨天牛成蟲中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該基因在啶蟲脒作用后的相對(duì)表達(dá)量最高，為空白對(duì)照表達(dá)量的11.59倍，其次是殺蟲雙，為8.02倍，綠僵菌和白僵菌的脅迫作用無(wú)顯著差異，毒死蜱和滅多威的作用效果較弱。不同殺蟲劑作用于MaEF2基因，導(dǎo)致其均有不同程度的上調(diào)表達(dá)，這可能是松墨天牛產(chǎn)生的自我保護(hù)反應(yīng)。生物有機(jī)體細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境壓力的能力是它們生存的關(guān)鍵，生物體在進(jìn)化過(guò)程中使其對(duì)環(huán)境和生理壓力具有一定的應(yīng)答能力[1]，然而許多應(yīng)答的共同特點(diǎn)是選擇性調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，包括允許可逆基因的快速表達(dá)[15-16]。目前研究表明環(huán)境壓力可誘導(dǎo) EF2 基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成以應(yīng)對(duì)環(huán)境條件的變化[17-18]。WANG等[1]研究了凡納濱對(duì)蝦EF2 基因在肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，EF2 基因在酸性條件處理下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低再增加的表達(dá)趨勢(shì)；在堿性條件處理下，結(jié)果同樣是呈現(xiàn)先增加后降低再增加的表達(dá)趨勢(shì)。在環(huán)境條件變化下，包括在殺蟲劑作用下松墨天牛 EF2 基因的具體功能和作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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