摘要[目的]觀察大黃（Rheum officinale）和公丁香（Flos caryophylli）對(duì)哈氏弧菌（Vibrio harveyi）及其生物膜（Biofilm）的體外抑制作用。[方法]采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定大黃和公丁香對(duì)哈氏弧菌的體外抑菌作用；采用倍比稀釋法測(cè)定大黃和公丁香對(duì)哈氏弧菌最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）；中圖分類(lèi)號(hào)S941.43文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）24-08188-03

The Inhibitory Activity of Flos caryophylli and Rheum officinale on Vibrio harveyi and Its Biofilm

LI Jiaqin， PANG Huanying et al（Fisheries College of Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088； Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals， Zhanjiang， Guangdong 524088； Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions， Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract[Objective] To observe the inhibitory effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on Vibrio harveyi and its biofilm. [Method] The inhibitory effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on Vibrio harveyi were tested by disc agar diffusion， and the MIC and MBC were detected by the double dilution； the effects of Rheum officinale and Flos caryophylli on the formation of Vibrio harveyi biofilm were measured by MTT assay. [Result] Rheum officinale had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone （DIZ） of （15.31±0.4） mm， and the MIC and MBC were 7.183 mg/ml； Flos caryophylli had inhibition effects with DIZ of （11.53±0.6） mm， and the MIC and MBC were 15.625 mg/ml， 62.5 mg/ml. Both Rheum officinale and Flos caryophylli exhibited a potent inhibitory activity against Vibrio harveyi biofilm formation （P<0.01）. [Conclusion] Rheum officinale and Flos caryophylli could significantly inhibit Vibrio harveyi and its biofilm.

Key wordsRheum officinalekl； Flos caryophylli； Vibrio harveyi； Biofilm； In vitro inhibitory activity

哈氏弧菌（Vibrio harveyi）隸屬弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），是一種革蘭氏陰性、發(fā)光海洋細(xì)菌，廣泛分布于海洋環(huán)境中[1]，是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的重要致病菌之一。該菌能夠感染中國(guó)對(duì)蝦（Penaeus chinensis）[2]、文蛤（Meretrix meretrix ）[3]和大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）[4]等多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。哈氏弧菌在水體中主要以生物膜（Biofilm）的形式生存。生物膜是細(xì)菌聚集粘結(jié)在一起分泌的黏性物質(zhì)，其主要成分為多糖、核酸、脂類(lèi)和蛋白等[5]。生物膜能保護(hù)細(xì)菌對(duì)抗外界危險(xiǎn)，增強(qiáng)其對(duì)抗菌藥物的耐受能力[6]。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要采用抗生素等化學(xué)藥物防治弧菌病，但抗生素的長(zhǎng)期使用會(huì)使病原產(chǎn)生耐藥性，會(huì)嚴(yán)重破壞養(yǎng)殖水域的生態(tài)環(huán)境，并且對(duì)人體健康構(gòu)成潛在的威脅[7]。因此，尋找安全有效的抗菌藥物是目前研究的熱點(diǎn)之一。

中草藥是我國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中最珍貴的財(cái)富之一，含有很多抗菌活性強(qiáng)、毒性低的有效成分。大黃和公丁香是常用的中草藥，它們?cè)诜乐嗡a(chǎn)動(dòng)物疾病中有著廣泛的應(yīng)用。曹紅峰等[8]證實(shí)大黃對(duì)致病性弧菌、魚(yú)害粘球菌（Myxococcuspiscolasp.nov.）和假單胞菌（Pseudomonadaceae）等常見(jiàn)水產(chǎn)動(dòng)物的病原菌有明顯的抑制作用。王玉娥等[9]證實(shí)哈氏弧菌對(duì)大黃和公丁香具有較高的敏感性。但是，關(guān)于這2種中藥對(duì)哈氏弧菌生物膜生成的抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)測(cè)定大黃和公丁香對(duì)哈氏弧菌及其生物膜的體外抑制作用，探索這2種中藥的抑菌作用和抗生物膜功能，以期為今后應(yīng)用中藥防治由該菌引起的弧菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和中草藥。哈氏弧菌HY99由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。大黃和公丁香購(gòu)自湛江春天藥房。

1.1.2試驗(yàn)儀器。SZ93自動(dòng)雙重雙蒸水蒸餾水器，購(gòu)自上海市亞榮生化儀器廠；自動(dòng)高壓滅菌鍋（HVE50），購(gòu)自日本HIRAYAMA公司；恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海市博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；搖床，由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

1.1.3主要試劑。MTT（Sigma公司）；結(jié)晶紫、冰醋酸、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、NaClDMSO（二甲基亞砜）均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4主要溶液和試劑的配制。①TSB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g以及NaCl 20 g，蒸餾水定容至1 000 ml（調(diào)節(jié)pH至7.2），高壓滅菌，4 ℃保存。②TSA固體培養(yǎng)基：TSB液體培養(yǎng)基（瓊脂粉濃度1.5%），高壓滅菌后，無(wú)菌條件下倒平板，凝固冷卻后4 ℃保存。③0.1%結(jié)晶紫染液：溶液A，結(jié)晶紫0.2 g、95%酒精20 ml；溶液B，草酸銨0.8 g、蒸餾水80 ml。將A、B溶液混合，濾紙過(guò)濾后短期使用。④0.85%生理鹽水：稱(chēng)取NaCl 0.85 g，用蒸餾水定容至1 000 ml，高壓滅菌后備用。⑤MTT 配制：稱(chēng)取MTT 0.5 g，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS），用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，置于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩＂轕BS緩沖液：A：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 1.44 g；B：磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.24 g，調(diào)節(jié)pH至7.4，定容1 L，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。⑦33%乙酸溶液：量取33 ml冰醋酸，用蒸餾水定溶至100 ml，搖勻備用。

1.2方法

1.2.1哈氏弧菌的培養(yǎng)。將菌株接種在含2%NaCl的TSB中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)18 h。用無(wú)菌TSB將菌懸液調(diào)節(jié)OD600nm約0.7備用。

1.2.2中草藥水煎液的制備。大黃資源豐富，價(jià)格低廉，并且對(duì)哈氏弧菌及其生物膜體外抑制效果較好，可選擇用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的弧菌病。筆者只是在細(xì)菌相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)，沒(méi)有考慮到環(huán)境和用藥方式等對(duì)藥效產(chǎn)生的影響，具有一定的局限性，今后仍需要在養(yǎng)殖環(huán)境和用藥方法上進(jìn)行綜合研究。

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