摘要[目的]研究剛毛檉柳水通道蛋白ThPIP基因啟動(dòng)子的克隆及其活性分析。[方法]采用染色體步移技術(shù)，克隆到剛毛檉柳ThPIP基因起始密碼子上游1 241 bp啟動(dòng)子序列，并通過PLACE和PlantCARE預(yù)測啟動(dòng)子序列中所包含的主要順式作用元件。將該啟動(dòng)子替換pCAMBIA1301上的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建融合表達(dá)基因proThPIP∷GUS，通過基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，并進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。[結(jié)果]該啟動(dòng)子具有活性，能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)。[結(jié)論] 為進(jìn)一步鑒定該啟動(dòng)子中的順式作用元件及相互作用的調(diào)控因子奠定基礎(chǔ)，從而為揭示剛毛檉柳ThPIP基因的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞剛毛檉柳；ThPIP基因；啟動(dòng)子克隆；瞬時(shí)表達(dá)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）24-08095-04

Cloning and GUS Activity Analysis of the Promoter of ThPIP Gene from Tamarix hispida

WANG Chao， WANG Yucheng et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding ， Northeast Forestry University ， Harbin ，Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective] The aim was to study cloning and GUS activity analysis of the promoter of ThPIP gene from Tamarix hispida. [Method] A 1241 bp promoter sequence of upstream of initial codon of ThPIP gene was obtained from Tamarix hispida by using the genome walking. Sequence analysis of the promoter region revealed several cisactivity elements in the promoter using the PLACE and PlantCARE. Further， the 35S promoter in pCAMBIA1301 was replaced with the ThPIP promoter to drive the βglucuronidase （GUS） gene， the proThPIP∷GUS recombinant construct was generated， which was transient expressed in tabacco leaves by the particle bombardment method. [Result]The histochemical GUS staining showed that the ThPIP promoter had activity and could drive the expression of GUS gene in tabacco leaves.[Conclusion] The study laid the foundation for further identifing the components and regulatory factors of interactions cis， in order to provide the basis for revealing regulatory mechanism of the ThPIP gene.

Key wordsTamarix hispida； ThPIP gene； Promoter cloning； Tansient expression

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs），是一類高效特異轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的整合膜蛋白，介導(dǎo)水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在植物生長發(fā)育以及逆境應(yīng)答中維持細(xì)胞滲透平衡具有重要作用[1]。植物AQPs是一個(gè)超家族[2]，高等植物AQPs 根據(jù)氨基酸序列同源性和亞細(xì)胞定位可以分為5 類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs：plasma membrane intrinsic proteins），液泡膜內(nèi)在蛋白（TIPs：tonoplast intrinsic proteins），類NOD26內(nèi)在蛋白（NIPs：NOD26-like intrinsic proteins），小分子堿性膜內(nèi)在蛋白（SIPs：small basic intrinsic proteins）和未鑒定的膜內(nèi)在蛋白（XIPs：X intrinsic proteins）[3]。迄今為止，已從多種植物中發(fā)現(xiàn)并克隆了編碼AQPs的基因，在擬南芥中有35個(gè)[4]，水稻中33個(gè)[5]，玉米中36個(gè)[6]，楊樹中54個(gè)[7]，煙草、菠菜、馬鈴薯和胡蘿卜等植物中都存在AQP基因[8]。雖然目前已經(jīng)克隆了多種植物的AQP基因，但關(guān)于該基因表達(dá)調(diào)控方面的研究尚少。因此，對該基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制的深入研究將為分子育種提高林木抗逆性提供理論基礎(chǔ)。

啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的一段DNA序列，包含多種順式作用元件，能夠與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合直接影響基因的表達(dá)量及表達(dá)位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因表達(dá)。因此，一定程度上決定了基因表達(dá)的時(shí)間和空間順序。常用的啟動(dòng)子按其作用方式及功能分為3類，即組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。目前，在植物表達(dá)載體中大多使用組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子和胭脂堿氨酸合成酶Nos啟動(dòng)子[9]，使外源基因在植物體內(nèi)部各部位都表達(dá)，在植物轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程中，逆境誘導(dǎo)型和組織特異型的啟動(dòng)子已成為研究熱點(diǎn)[10]。

檉柳（Tamarix sp.）是一種具有良好的抗旱、耐鹽能力的木本植物，能在含鹽量1%的重鹽堿土上生長，顯示其具有一套有效的抗逆系統(tǒng)及相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。目前，盡管已克隆了部分檉柳的抗逆相關(guān)基因，并對其功能進(jìn)行了鑒定，但對抗逆基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和分子調(diào)控機(jī)制研究極少。筆者利用染色體歩移技術(shù)從剛毛檉柳中克隆ThPIP基因上游調(diào)控1 241 bp啟動(dòng)子序列，并將該啟動(dòng)子通過PLACE和PlantCARE進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測啟動(dòng)子序列中所包含的主要順式作用元件。構(gòu)建融合表達(dá)基因proThPIP∷GUS，通過基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，并通過GUS組織化學(xué)染色分析剛毛檉柳ThPIP基因啟動(dòng)子的活性。為進(jìn)一步鑒定該啟動(dòng)子中的順式作用元件及相互作用的調(diào)控因子奠定基礎(chǔ)，從而為揭示剛毛檉柳ThPIP基因的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料剛毛檉柳（Tamarix hispida）種子采自中國科學(xué)院吐魯番沙漠植物園，將種子栽種在溫室中[光照14 h/d，光照強(qiáng)度為400 μmol/（m2·s），溫室的相對濕度為65%～75%，平均溫度為24 ℃]，其生長基質(zhì)為草炭土與沙（1∶3）；野生型小葉煙草（Nicotianatabacum）種子由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、pCAMBIA1301載體質(zhì)粒、根癌農(nóng)桿菌（EHA105）菌種為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)MEGA；染色體步移試劑盒（Genome Walking Kit）、pMD18TMT載體、T4 DNA連接酶、LA Taq和DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；dNTP Mixture、DNA序列合成及測序在上海生工生物工程股份有限公司完成。其他藥品試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1剛毛檉柳基因組DNA 的提取。以溫室土培的2月齡整株剛毛檉柳幼苗為材料，采用CTAB法提取整株幼苗的基因組DNA[11]，略有改進(jìn)。

1.2.2ThPIP基因啟動(dòng)子克隆及序列分析。利用新一代高通量測序Solexa技術(shù)建立剛毛檉柳根組織在NaHCO3脅迫下0、6、24和48 h的4個(gè)轉(zhuǎn)錄組[12]，將獲得的Unigenes序列通過NR和SwissProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對，得知ThPIP基因全長序列。利用染色體步移試劑盒（Genome Walking Kit），根據(jù)已有序列設(shè)計(jì)3 條特異引物SP1、SP2和SP3，SP2 的位置設(shè)計(jì)在SP1 的內(nèi)側(cè)，SP3 位于SP2 的內(nèi)側(cè)。3條特異引物的序列分別為SP1：5’CTATGAACTCAGCTATACATGC3’，SP2：5’GGAGCTGGTGGTGGATCTAC3’，SP3：5’TCTGTGGAGCTGGCTCTGTC3’；隨機(jī)引物AP1、AP2、AP3和AP4由試劑盒提供。

參考染色體步移試劑盒提供的說明書，以檉柳基因組DNA為模板，以上述合成的特異引物和隨機(jī)引物的不同組合為引物，經(jīng)3輪PCR 反應(yīng)擴(kuò)增ThPIP基因上游側(cè)翼序列。PCR擴(kuò)增的目的條帶通過膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收后的產(chǎn)物與pMDTM18T載體相連，取連接液熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將鑒定為陽性的菌液通過PCR驗(yàn)證后，再送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

利用分子生物學(xué)軟件PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）[13]和PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[14]對測序得到的啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、潛在的順式元件等進(jìn)行預(yù)測分析。

2結(jié)果與分析

2.1ThPIP基因啟動(dòng)子克隆及序列分析以整株剛毛檉柳幼苗的基因組DNA 為模板，利用染色體步移技術(shù)，經(jīng)過3輪巢式PCR，得到1條長約1.2 kb的片段（圖2），膠回收該片段并連接至pMDTM18T 克隆載體上，通過序列測序，發(fā)現(xiàn)該序列的3’端87 bp與ThPIP基因相對的Unigene序列完全一致，表明擴(kuò)增的側(cè)翼序列是ThPIP基因的上游序列，其長度為啟動(dòng)子序列片段1 241 bp。

圖4在煙草中瞬時(shí)表達(dá)的GUS組織化學(xué)分析3討論

植物在生長和發(fā)育、生理代謝以及響應(yīng)逆境脅迫過程中，基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。這一過程是通過轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子上特定的順式作用元件相互作用，特異性地調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)一系列生理、代謝反應(yīng)，形成高效有序的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因而基因啟動(dòng)子中的順式作用元件則是決定基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因素，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合何種順式作用元件，決定了其調(diào)控哪些基因的表達(dá)。

啟動(dòng)子在植物基因表達(dá)調(diào)控研究中具有重要作用，但在沒有全基因組測序的情況下，啟動(dòng)子的克隆是一項(xiàng)重要而又艱難的工作，目前有很多克隆啟動(dòng)子的方法，如載體錨定PCR、反向PCR、接頭PCR、AdaptorPCR和Tail PCR[20]。檉柳是一種優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物，耐干旱、鹽堿、貧瘠、風(fēng)蝕和沙埋[21]，是研究木本植物抗逆機(jī)理的理想材料。但關(guān)于檉柳的基因組信息相對匱乏，該研究使用Tail PCR方法，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中已知的Unigenes序列，高效獲取ThPIP基因的側(cè)翼未知序列，相對其他傳統(tǒng)方法，該方法具有高效、簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高和一次性獲得較長未知序列等優(yōu)點(diǎn)。

研究表明，AQPs基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，顯示其參與植物鹽脅迫應(yīng)答過程[22-23]。此外，AQPs 也參與鹽脅迫下其他信號(hào)應(yīng)答調(diào)控[24-25]。但其在植物耐鹽過程中的調(diào)控機(jī)理研究相對較少。該研究利用Genome Walking試劑盒克隆了長度1 241 bp的ThPIP基因啟動(dòng)子序列，并利用PLACE和PlantCARE對該序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除具有啟動(dòng)子的基本核心元件TATAbox，還包含多個(gè)與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件，如MYB1AT、MYBCORE、MYCCONSEN、 WRKY71OS，初步表明該基因可能參與植物的逆境脅迫響應(yīng)。為了驗(yàn)證該啟動(dòng)子的活性，將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，代替35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)，基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，表明其具有啟動(dòng)子活性，能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)。為了詳細(xì)闡述水通道蛋白ThPIP啟動(dòng)子功能，還需要進(jìn)一步的深入研究，如通過酵母單雜交篩選其上游調(diào)控因子，再將啟動(dòng)子上的元件進(jìn)行突變或者缺失等驗(yàn)證與上游調(diào)控因子的互作情況，進(jìn)而揭示ThPIP基因的功能和分子調(diào)控機(jī)制。

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