摘要[目的]了解柿樹內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及分布規(guī)律。[方法]采用平板分離法對柿樹內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行首次分離、篩選和鑒定。[結(jié)果]從柿樹根、幼莖和葉中共分離出內(nèi)生細(xì)菌11株,不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量存在差異;經(jīng)菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)觀察鑒定分屬于4個屬,即短小桿菌屬(Curtobacterium)1株、芽孢桿菌屬(Bacillus)7株、乳桿菌屬(Lactobacillus)1株、假單胞菌屬(Pseudomonas)2株。[結(jié)論]柿樹內(nèi)生細(xì)菌具有生物多樣性。
關(guān)鍵詞柿樹;內(nèi)生細(xì)菌;鑒定
中圖分類號S432.4+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2014)24-08175-02
Isolation and Identification of Entophytic Bacteria from Diospyros kaki Thunb
WANG Gengxian et al(School of Life Science and Engineering, Handan College, Handan, Hebei 056005)
Abstract[Objective] The aim was to understand the biological diversity and distribution law of entophytic bacteria from persimmon. [Method] The entophytic bacteria of persimmon were primarily isolated, screened and identified by using plateisolating method. [Result] Eleven strains of entophytic bacteria were isolated from the roots, young stems and leaves of persimmon using the streak plate method. The population densities varied with tissues of the plant. Through the morphology of the colony and microscopic identification, they belonged to four genera, including Curtobacterium (one strain), Bacillus (seven strains), Lactobacillus (one strain) and Pseudomonas (two strains). [Conclusoion] The entophytic bacteria of persimmon have biological diversity.
Key wordsDiospyros kaki Thunb; Entophytic bacteria; Identification
植物內(nèi)生細(xì)菌泛指那些在其生活史的某一階段生活在植物組織內(nèi)但不引起植物組織明顯病害癥狀的一類微生物[1]。近年來,關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于植物病害防治方面的研究越來越多,目前已成為植物病害生物防治的主要藥源之一,具有較高的理論研究價值和實際應(yīng)用價值[2]。研究表明,幾乎所有的植物體內(nèi)都含有內(nèi)生細(xì)菌,并產(chǎn)生內(nèi)生細(xì)菌和其宿主植物長期共存的現(xiàn)象。內(nèi)生細(xì)菌對寄主植物有促生、防病、內(nèi)生固氮等廣泛的生物學(xué)作用[3-4]。
柿樹在全國各地廣為栽培,是古老的栽培果樹之一,也是我國重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一[5]。在柿樹的生長過程中常受到多種病原菌的危害,目前我國柿樹病害已知有16種,其中以角斑病、圓斑病和炭疽病發(fā)生較普遍且嚴(yán)重,給柿子的生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。目前的防治手段主要以化學(xué)農(nóng)藥為主,但長期使用農(nóng)藥不僅影響柿子的品質(zhì),還會給環(huán)境帶來危害,所以探尋生物防治的途徑勢在必行。為此,筆者對柿樹內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了首次分離、篩選和鑒定,初步研究了柿樹內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及分布規(guī)律,旨在為今后柿樹微生物防治和內(nèi)生細(xì)菌資源的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試品種。供試柿樹品種為磨盤柿(Diospyros kaki L.f.constricta),于2013年5月采自邯鄲學(xué)院校園內(nèi)。采集健康植株的根、幼莖、葉供試驗用。
1.1.2培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂(NA):牛肉膏 3 g,蛋白胨 10 g,NaCl 5 g,瓊脂 20 g,蒸餾水 1 000 ml,pH 6.5~7.5。
1.2方法
1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離和測數(shù)。參考饒小莉等[7]的方法,取經(jīng)表面滅菌徹底的材料1.00 g于無菌研缽中研磨,將研磨的組織加到含0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中,旋窩振蕩1 min,將上清液倒入滅菌的離心管中沉淀,吸取1.0 ml上清液做梯度稀釋,分別取0.1 ml稀釋液涂布NA平板,每個稀釋濃度3次重復(fù),置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng),3~5 d后計菌落數(shù)。根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、大小等挑取單菌落,反復(fù)劃線純化后接斜面保存,供測試鑒定。
1.2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定。分離細(xì)菌菌株的鑒定主要參考《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[8]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9],測定菌株的形態(tài)、培養(yǎng)性狀和生理生化特性。
2結(jié)果與分析
43討論
該研究雖然發(fā)現(xiàn)柿樹根、幼莖、葉3種器官中存在不同種類的內(nèi)生細(xì)菌,但是提取到的菌株種類與其他研究報道的數(shù)10種甚至近百種仍相差很遠(yuǎn)。雖然其原因不排除柿樹本身含有的內(nèi)生細(xì)菌種類較少,但是可能與試驗中選用的材料為生長年份較少的柿樹有關(guān),幼嫩組織分裂生長很快導(dǎo)致其內(nèi)生細(xì)菌的含量相對較低。此外,分離內(nèi)生細(xì)菌時采用組織塊分離法,導(dǎo)致非切口處組織的內(nèi)生細(xì)菌很難被提取出來,而將組織研磨破碎得到提取液涂布培養(yǎng)可能會使之得以改善。
植物各種組織內(nèi)生細(xì)菌種類存在差異可能是因為不同器官的結(jié)構(gòu)不同,各器官所處微環(huán)境(如通氣、營養(yǎng)、細(xì)胞理化環(huán)境等)不同。因此,有必要對內(nèi)生細(xì)菌的侵染機理進(jìn)行研究,以便更好地探究柿樹內(nèi)生細(xì)菌種群分布規(guī)律,為今后進(jìn)一步研究柿樹內(nèi)生細(xì)菌提供依據(jù)。該研究為進(jìn)一步研究內(nèi)生細(xì)菌對柿樹的作用奠定了基礎(chǔ),不僅使人們對柿樹各組織、器官內(nèi)可能含有的內(nèi)生細(xì)菌有所了解,而且為柿樹病害的防治提供了新思路。
參考文獻(xiàn)
[1] 張祺玲,楊宇紅,譚周進(jìn),等.植物內(nèi)生菌的功能研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2010(7):37-44.
[2] 閆孟紅,蔡正求,韓繼光,等.植物內(nèi)生細(xì)菌在防治植物病害中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].生物技術(shù)通報,2004,30(3):8-12.
[3] 楊海蓮,孫曉璐,送未,等.植物內(nèi)生細(xì)菌的研究[J].微生物學(xué)通報,1998,25(4):224-226.
[4] 羅永蘭,張志遠(yuǎn),喻珺.柑橘內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,45(6):773-775.
[5] 胡青素,龔榜初,譚曉風(fēng),等.柿子的應(yīng)用價值及發(fā)展前景[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(1):103-106.
[6] 郭昌賢.柿樹病害的癥狀與防治[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2008,14(1):12-13.
[7] 饒小莉,沈德龍,李俊,等.甘草內(nèi)生細(xì)菌的分離及拮抗菌株鑒定[J].微生物學(xué)通報,2007(4):117-123.
[8] 中國科學(xué)院微生物所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法[M].北京:科學(xué)出版社,1978.
[9] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[K].北京:科學(xué)出版社,2001.