摘要[目的]研究生物磁效應(yīng)對蛹蟲草（Cordyceps militaris）液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響。[方法]利用場強為0.10 T、0.25 T、0.40 T恒定磁場，以流速為1 m/s，分別對普通水進(jìn)行9次處理，串聯(lián)（SC）磁場處理3次的磁處理水，用于液體培養(yǎng)蛹蟲草，研究了生物磁效應(yīng)對蛹蟲草胞外蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶、蟲草素、蟲草酸、多糖含量及菌絲干重的影響，并且對胞外酶活性與以上指標(biāo)相關(guān)性進(jìn)行了分析。[結(jié)果]0.40 T處理能顯著促進(jìn)蛹蟲草胞外蛋白酶和多酚氧化酶活性，提高菌絲干重及蟲草酸含量，相比對照組，其酶活高峰分別提高了38.98%和16.75%，菌絲干重和蟲草酸分別提高了27.12%和22.93%；0.10 T處理可顯著提高胞外淀粉酶活性和多糖含量，相比對照組，酶活高峰提高了34.94%，多糖含量提高了18.32%；0.25 T處理有利于蟲草素的積累，比對照組提高了16.49%。相關(guān)性分析結(jié)果表明，胞外蛋白酶活性與菌絲干重、蟲草酸含量在0.05水平呈顯著正相關(guān)，為關(guān)鍵酶。[結(jié)論]不同場強處理的磁化水均能顯著提高蛹蟲草液體培養(yǎng)胞外酶活性、菌絲干重及主要藥用成分含量，但影響規(guī)律存在一定的差異性，可為發(fā)酵生產(chǎn)蛹蟲草藥用成分提供理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞磁效應(yīng)；蛹蟲草；液體發(fā)酵；胞外酶活性；菌絲干重；活性物質(zhì)含量

中圖分類號S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08102-06

Effects of Biomagnetic Effect on the Submerged Cultures of Cordyceps militaris

ZHAO Bo， ZHANG Guocai et al （Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To explore the effects of biomagnetic effect on Cordyceps militaris in submerged cultures. [Method] The water was treated by using magnetic treatment with field strength of 0.1， 0.25， 0.40 T for 9 times at flow velocity with 1 m/s and the series connection（SC）for 3 times simultaneously to submerged culture. The influence of different magnetic field strength on the activity of extracellular amylase， protease， polyphenol oxidase and mycelial dry weight， cordycepin， cordycepic acid （Dmannitol）， polysaccharide by the mycelial of Cordyceps militaris were investigated. Furthermore， the relationship between extracellular enzyme activity and above indicators was analyzed. [Result] The 0.4T treatment could obviously promote the activity of extracellular protease and polyphenol oxidase， and was favorable for mycelial growth and cordycepic acid production， which increased 38.98%， 16.75%， 27.12% and 22.93% compared with the contrast， respectively. The 0.1 T treatment could obviously promote the activity of extracellular amylase， and was favorable for polysaccharide production in the submerged culture， which increased 34.94% and 18.32% compared with the contrast. The 0.25 T treatment was favorable for cordycepin production of Cordyceps militaris， which increased 16.49% compared with the contrast. Further correlation analysis indicated that the extracellular protease activity and mycelial dry weight and cordycepic acid content were significant positive correlated at P<0.05 level， which was the key factor in the submerged cultures. [Conclusion] Different magnetized water had significant effect on the extracellular enzyme activity， mycelial growth and medicinal ingredients content in submerged cultures of Cordyceps militaris， though the influence rules of magnetized water on different substance existed differences， which could provide theoretical basis and reference to produce medicinal ingredients of Cordyceps militaris.

Key words Biomagnetic effect； Cordyceps militaris； Submerged culture； Extracellular enzyme activity； Mycelial dry weight； Bioactive metabolite

蛹蟲草[Cordyceps militaris（Vuill.） Fr.]屬子囊菌門（Ascomycota）昆蟲寄生真菌[1]，又名北冬蟲夏草，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一。研究表明，蛹蟲草作為一種重要的林下藥用資源，富含多核苷、多糖、生物堿、甾醇、環(huán)狀縮羧肽等多種活性物質(zhì)[2]，具有抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗氧化/衰老[5]、抗纖維化[6]、抗轉(zhuǎn)移[7]、抗菌[8]、抗疲勞[9]、改善胰島素分泌[10]、保肝[11] 、調(diào)節(jié)免疫[12]等諸多藥理作用。近年來，中草藥因其綠色、無毒副作用的優(yōu)點被世界廣泛接受和關(guān)注。以生物源特別是生物代謝產(chǎn)物為先導(dǎo)物合成新型藥物成為未來制藥學(xué)發(fā)展的必然趨勢。在此進(jìn)程中，蛹蟲草因其諸多優(yōu)點，國內(nèi)外專家學(xué)者對其寄予厚望。

生物磁效應(yīng)是指環(huán)境磁場、外加磁場及自身產(chǎn)生的生物磁對生物的生命活動或組織產(chǎn)生的作用。作為一門新興邊緣科學(xué)，生物磁效應(yīng)已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)及環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，利用磁處理水培養(yǎng)食用菌可明顯提高菌絲體中酶活性，促進(jìn)菌絲生長和子實體分化[13]，縮短生產(chǎn)周期[14]，提高食用菌產(chǎn)量[15]和品質(zhì)[16]。目前，生物磁效應(yīng)對靈芝、杏鮑菇、香菇等食藥用菌的影響已被大量實驗所證實[16-18]，部分成果已得到應(yīng)用，但對利用生物磁技術(shù)液體發(fā)酵蛹蟲草的研究未見報道。此外，以往生物磁效應(yīng)的研究往往局限于對目標(biāo)產(chǎn)物含量或酶活性的單一分析，因此利用經(jīng)不同磁場強度處理的磁處理水液體培養(yǎng)蛹蟲草，對其主要胞外酶活性、菌絲干重及主要藥用成分含量進(jìn)行了測定，并在此基礎(chǔ)上對蛹蟲草胞外酶活性與菌絲干重、藥用成分含量進(jìn)行了相關(guān)分析，以期在獲得更高的菌絲干重、蟲草素、蟲草酸及多糖產(chǎn)量的同時，為進(jìn)一步合理、高效開發(fā)與利用蛹蟲草資源，研究生物磁效應(yīng)對大型真菌的影響機理提供參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器蛹蟲草母種（由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)國家級重點實驗室保藏），蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司），蟲草酸（Dmannitol，Sigma公司），葡糖糖（Sigma公司），L鼠李糖（進(jìn)口分裝），酪蛋白（Sigma公司），乙腈（Dikma公司），福林酚工作液（進(jìn)口分裝），其他藥品均為分析純。

CARY紫外分光光度計；Waters2695高效液相色譜儀；Biofuge Stratos高速冷凍離心機；R1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；磁場強度為0.10 T、0.25 T、0.40 T永磁棒。

1.2磁處理培養(yǎng)基的制備將普通水以流速為1 m/s，豎直通過磁程30 cm、磁場強度分別為0.10 T、0.25 T、0.40 T的永磁棒，垂直切割磁感線9次，經(jīng)串聯(lián)磁場（SC，將磁場強度為0.10 T、0.25 T、0.40 T的3個永磁棒依次連接獲得的磁場）3次，制成磁程相同的磁處理水。同時，分別配制成配方為馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L的液體培養(yǎng)基。向每個三角瓶準(zhǔn)確加入液體培養(yǎng)基250 ml，121 ℃高壓滅菌20 min，以普通水培養(yǎng)基為對照。

1.3菌株活化與培養(yǎng)將母種接種于配方馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉16 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L的平面培養(yǎng)基中，于20 ℃條件下培養(yǎng)5 d，制得活化菌株。

將活化后的菌種用打孔器沿菌落外邊（保證菌齡一致）制成大小相同、直徑為10 mm菌柄，并且分別接種于以上不同磁處理水及對照液體培養(yǎng)基中。每個瓶接入菌柄3個，每個處理重復(fù)6次，置于搖床中，在22 ℃、150 r/min條件下[19]恒溫振蕩培養(yǎng)9 d。

1.4蛹蟲草胞外酶活性的測定

1.4.1粗酶液的制備。每個處理重復(fù)3個。在超凈工作臺，每24 h精確取培養(yǎng)液1次，每瓶5 ml。將同一處理組樣混勻，于4 ℃，4 000×g條件下離心10 min，取上清即為胞外粗酶液[13]，置于4 ℃冰箱中保存。

1.4.2胞外淀粉酶活性的測定。在試管中加濃度0.5%可溶性淀粉溶液1.5 ml，再加入稀釋5倍的粗酶液0.5 ml，充分混勻，置于38 ℃恒溫水浴鍋中30 min，然后立即加入DNS試劑1.5 ml，放入沸水中煮沸5 min，取出冷卻，紫外分光光度計520 nm測定OD值，以煮沸15 min的粗酶液為對照[20]。胞外淀粉酶活力以每毫升樣品與底物反應(yīng)30 min改變0.01個吸光度為一個活力單位。

1.4.3胞外蛋白酶活性的測定。向試管中加入經(jīng)水浴40 ℃預(yù)熱5 min的濃度2%酪蛋白溶液1 ml，采用同法預(yù)熱的粗酶液1 ml，40 ℃水浴恒溫20 min，取出后立即加入2 ml 0.4 mol/L三氯醋酸溶液，4 000×g離心10 min。取上清液1 ml，轉(zhuǎn)入另一試管中，依次加入5 ml 0.4 mol/L碳酸鈉溶液及1 ml福林酚工作液， 40 ℃恒溫水浴顯色20 min，于680 nm處測定吸光度[21] 。以每毫升樣品與底物反應(yīng)30 min改變0.01個吸光度作為一個酶活力單位。

1.4.4胞外多酚氧化酶活性的測定。在試管中依次加入2 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.0）和2 ml 0.1 mol/L鄰苯二酚溶液，再加入粗酶液0.5 ml，立即置于28 ℃水浴鍋中恒溫30 min，并且立即在400 nm處測定其吸光度，以煮沸15 min的粗酶液為對照[22]。以每毫升樣品與底物反應(yīng)30 min改變0.01個吸光度作為一個酶活力單位。

1.5蛹蟲草菌絲干重及活性物質(zhì)含量的測定

1.5.1菌絲干重和干粉的制備。將每個處理其余3個重復(fù)連續(xù)培養(yǎng)9 d，真空抽濾培養(yǎng)液，并且用等量的蒸餾水清洗3次，將所得菌絲置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重，分析天平稱量即為菌絲干重。將以上所得干燥菌絲合并，用液氮研磨，充分混勻后，過80目篩，即得蛹蟲草液體培養(yǎng)菌絲干粉，并且置于干燥器中避光保存，備用。

1.5.2蟲草素含量的測定。精確稱取菌絲干粉1.00 0 g，加入乙醚20 ml，冰水浴超聲脫脂20 min，重復(fù)3次[23]，除盡乙醚后，加入蒸餾水8 ml，超聲提取3次，每次20 min， 合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60 ℃條件下蒸干，以濃度6%乙腈溶解，定容至100 ml，備用[24]。采用HPLC色譜法測定[24]，色譜條件為：Ultimate AQC18（250 mm×4.6 mm）色譜柱，流動相為濃度6%乙腈，0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，流速0.6 ml/ min，進(jìn)樣量為10 μl，檢測限為0.02 AUF。

1.5.3蟲草酸含量的測定。精確稱取菌絲干粉1.000 g，加蒸餾水50 ml，在80 ℃水浴條件下浸提2 h，8 000×g離心10 min，加蒸餾水50 ml，清洗沉淀2次，合并濾液，定容至200 ml，再精確吸取溶液1 ml，以蒸餾水定容至10 ml容量瓶中，待測。采用紫外分光光度法測定[24]。

1.5.4多糖含量的測定。精確稱取子座干粉1.000 g，加入濃度80%乙醇10 ml，超聲30 min，重復(fù)3次，8 000×g離心30 min，去上清液[25]，加入蒸餾水10 ml，于高壓滅菌鍋中121 ℃提取15 min[26]，8 000×g離心30 min，取上清液，加入4倍量的無水乙醇，放入4 ℃冰箱過夜。將經(jīng)充分沉淀的提取液在10 000×g條件下離心30 min，小心去除上清液，沉淀用無水丙酮洗滌2次后定容至1 000 ml容量瓶中備用。采用苯酚-硫酸法測定[27]。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析。差異顯著性檢驗采用LSD法。相關(guān)性分析選用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行單側(cè)顯著性檢驗。胞外酶活性取9 d平均值后進(jìn)行分析。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年2結(jié)果與分析

2.1不同磁場強度對蛹蟲草胞外淀粉酶活性的影響由圖1可知，在蛹蟲草液體培養(yǎng)的整個過程中，5個處理組的蛹蟲草胞外淀粉酶活性整體變化趨勢基本一致，即酶活性自培養(yǎng)的開始階段便大量分泌，直至第3天酶均出現(xiàn)活性高峰，隨后緩慢下降，至第6天后變化趨勢趨于平穩(wěn)，且活性均較低。不同磁處理組淀粉酶活性均高于對照組，其中以0.10 T處理組中酶活最高，達(dá)44.8 U，分別比0.25 T、0.40 T、串聯(lián)、對照組提高了15.46%、7.18%、22.40%和34.94%，且各組差異均在0.01顯著水平。由此可知，經(jīng)不同場強、方式處理的磁化水均能顯著提高蛹蟲草淀粉酶活性，促進(jìn)淀粉酶的分泌，以0.1 T磁處理水效果最為顯著。

2.2不同磁場強度對蛹蟲草胞外蛋白酶活性的影響由圖2可知，在蛹蟲草液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)開始階段蛋白酶分泌較緩慢，至第6天開始快速分泌，活性高峰出現(xiàn)時間比淀粉酶活性晚，對照組蛋白酶的活性高峰出現(xiàn)在第8天，相對活性為49.0 U，至第9天隨即迅速下降至11.2 U，至第10天變化趨勢較平緩，并且略有下降。

在磁化水處理組中蛋白酶活性均高于對照組，其中以0.40 T處理組最高，達(dá)68.1 U，相比對照組酶活高峰提高了38.98%，差異在0.01水平顯著。同時，在0.25 T、0.40 T及串聯(lián)處理組中蛋白酶活性第7天便達(dá)到活性頂點，而0.10 T處理組與對照組酶活高峰均出現(xiàn)在第8天，但仍高于對照組。由此可知，經(jīng)不同場強及方式處理的磁化水均能顯著促進(jìn)蛹蟲草液體培養(yǎng)胞外蛋白酶的分泌，提高胞外蛋白酶活性，以0.40 T磁處理水的促進(jìn)效果最顯著。注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖1不同磁處理水對蛹蟲草胞外淀粉酶活性的影響注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖2不同磁處理水對蛹蟲草胞外蛋白酶活性的影響2.3不同磁場強度對蛹蟲草胞外多酚氧化酶活性的影響由圖3可知，在整個培養(yǎng)過程中，5個處理的蛹蟲草多酚氧化酶活性變化趨勢基本保持一致，在培養(yǎng)開始階段即開始緩慢分泌，酶活性逐漸升高，至第8天達(dá)到活性頂點。在不同磁化水處理組中，胞外多酚氧化酶活性均高于對照組，010 T處理組在培養(yǎng)1～7 d相比具有較高多酚氧化酶活性，且均高于其他處理組。這與以上淀粉酶活性趨勢相似，但在培養(yǎng)的1～3 d各組間差異均不顯著（P>0.05），至第4～5天，僅0.10 T處理組與對照組在0.05水平上存在顯著差異。至培養(yǎng)的第6～7天，除0.10 T處理組與對照組多酚氧化酶活性存在極顯著差異（P<0.01）外，其余各組間均不存在極顯著差異（P>0.01），但在0.05水平上差異不盡相同。第8天，040 T、0.25 T處理組多酚氧化酶活性快速提高且高于0.10 T處理組，其中以0.40 T處理組酶活性最高，達(dá)23.0 U，相比0.10 T、0.25 T、串聯(lián)處理組及對照組分別提高了550%、222%、11.11%和16.75%，且與串聯(lián)處理組和對照組間存在極顯著差異（P<0.01）。由此可知，經(jīng)不同場強及方式處理的磁化水均能在一定水平上提高蛹蟲草胞外多酚氧化酶活性，促進(jìn)其分泌，在培養(yǎng)開始階段以0.10 T磁處理水效果最為明顯，在培養(yǎng)后期則以0.40 T磁處理水效果最為顯著。注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖3不同磁處理水對蛹蟲草胞外多酚氧化酶活性的影響2.4不同磁場強度對蛹蟲草菌絲干重的影響由圖4可知，利用經(jīng)不同磁場強度和方式處理的磁化水液體培養(yǎng)蛹蟲草，其菌絲干重均高于對照組，整體呈上升趨勢。與對照組相比，在010 T、025 T及串聯(lián)處理組中菌絲干重分別提高了5.08%、21.19%和14.40%。0.40 T處理組菌絲干重最大，為1.50 g/100 ml，相比對照組提高了27.12%。方差分析結(jié)果表明，各處理組與對照組菌絲干重間均存在極顯著差異（P<0.01）。

注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖4不同磁處理水對蛹蟲草菌絲干重的影響2.5不同磁場強度對蛹蟲草蟲草酸含量的影響由圖5可知，各處理組蟲草酸含量均高于對照組，隨著磁場強度的提高整體呈上升趨勢。0.40 T處理組蟲草酸含量最高，達(dá)6932 mg/g，相比對照組提高了22.93%；與對照組相比，在010 T、0.25 T、串聯(lián)處理組中，蟲草酸含量分別提高了567%、 15.65%和11.07%。方差分析結(jié)果表明，各處理組間蟲草酸含量均存在極顯著差異（P<0.01），以0.40 T磁處理水提高效果最為明顯。這與以上菌絲干重所得結(jié)果、趨勢基本相同。

注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖5不同磁處理水對蛹蟲草蟲草酸含量的影響2.6不同磁場強度對蛹蟲草蟲草素含量的影響由圖6可知，各處理組蟲草素含量均高于對照組，0.25 T處理組蟲草素含量最高，為3.32 mg/g，相比0.10 T、0.40 T、串聯(lián)處理組和對照組分別提高了14.48%、2.78%、8.50%和16.49%，其次為0.40 T處理組，蟲草素含量為3.23 mg/g，比對照組提高了13.33%。方差分析結(jié)果表明，0.10 T處理組與對照組間蟲草素含量差異不顯著（P>0.05），但與其余各處理組間均存在極顯著差異（P<0.01），0.25 T與0.40 T處理組間在001水平上差異不顯著，但在0.05水平差異顯著。與菌絲干重和蟲草酸含量趨勢不同，0.25 T處理組中蛹蟲草蟲草素含量均高于0.10 T和0.40 T處理組，說明磁處理強度對蛹蟲草蟲草素含量的影響并非呈線性相關(guān)。

注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖6不同磁處理水對蛹蟲草蟲草素含量的影響2.7不同磁場強度對蛹蟲草多糖含量的影響由圖7可知，不同磁場強度和方式處理的磁處理水液體培養(yǎng)蛹蟲草，其多糖含量均高于對照組，但與磁處理影響蟲草酸含量趨勢相反，隨著磁場強度的增加，整體呈下降趨勢。其中，0.10 T處理組多糖含量最高，為36.30 mg/g，高于對照組18.32%。方差分析結(jié)果表明，各處理組間多糖含量均存在極顯著差異（P<0.01）。

注：不同大小寫字母分別表示差異在0.01、0.05水平顯著。

圖7不同磁處理水對蛹蟲草蟲草多糖含量的影響表1不同磁處理水對蛹蟲草胞外酶活性與活性物質(zhì)含量影響相關(guān)性分析

指標(biāo)蛋白酶活性淀粉酶活性多酚氧化酶活性菌絲干重0.815**-0.0880.564蟲草酸含量0.864**0.0210.637多糖含量-0.1780.3840.655蟲草素含量0.678*-0.1960.429注：*表示在0.1水平上顯著，**表示在0.05水平顯著。

2.8相關(guān)性分析由表1可知，利用不同磁場強度和方式處理的磁處理水液體培養(yǎng)蛹蟲草，胞外蛋白酶活性與菌絲干重、蟲草酸含量在0.05水平呈顯著正相關(guān)，在0.1水平與蟲草素含量呈顯著正相關(guān)，與多糖含量卻呈一定程度的負(fù)相關(guān)（P=0.387）。胞外淀粉酶活性與多糖含量呈正相關(guān)（P=0.262），但與菌絲干重、蟲草酸含量及蟲草素含量相關(guān)性較弱。胞外多酚氧化酶活性與菌絲干重、蟲草酸含量和蟲草素含量呈正相關(guān)（P=0.161、P=0.124、P=0.115、P=0.235）。

3結(jié)論與討論

外加磁場對生物產(chǎn)生的影響是生物磁學(xué)中重要的研究與應(yīng)用領(lǐng)域。研究表明，外加磁場產(chǎn)生生物磁效應(yīng)的強弱和性質(zhì)既與受磁場作用的生物種類和組織器官的磁性、組成、部位有關(guān)，又與作用磁場的磁場類型、強度、頻率、方向、時間及分布密切相關(guān)。由此可知，生物磁效應(yīng)的機理具有復(fù)雜性[28]。Francehetti[29]認(rèn)為，磁場對生物的作用具有臨界磁場效應(yīng)、磁滯后效應(yīng)、生物放大效應(yīng)及磁場積累效應(yīng)的特點。與此同時，生物磁效應(yīng)對生物體的多種生理代謝過程和細(xì)胞組織產(chǎn)生的影響是多方面的，如對抗輻射的影響，對免疫功能的作用，對生殖細(xì)胞的影響，對肝、腎的影響，對多種酶類活動的影響，對糖、脂類、蛋白質(zhì)、核酸、自由基等的影響等[30]。

在普通水分子切割磁感線過程中，在磁場的作用下，水分子氫鍵被拉伸甚至斷裂，水分子締合度下降，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[31]。研究表明，磁處理水除核磁共振譜、紅外光譜無明顯變化外，其對pH、溶氧能力、難溶鹽的溶解度、揮發(fā)性、密度、吸光度及紫外吸收峰也均發(fā)生變化[32]。多數(shù)研究者認(rèn)為，正是這些變化在影響生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的同時，又影響了Fe、Mn、Zn等金屬離子的含量和性質(zhì)，進(jìn)一步影響了某些或某類特定酶的活性，從而引發(fā)了一系列的生物效應(yīng)。

食用菌胞外酶分泌、活性及變化與其生長和發(fā)育關(guān)系十分密切。在培養(yǎng)過程中，對食用菌胞外酶分泌特點和活性變化進(jìn)行研究，對優(yōu)良菌株選育、提高栽培技術(shù)具有重要意義[33]。經(jīng)不同場強及處理方式的磁處理水均能促進(jìn)蛹蟲草胞外蛋白酶、淀粉酶及多酚氧化酶的分泌，提高其活性，但不同磁處理水對不同酶的影響效果存在差異性。0.10 T的磁處理水可顯著提高其淀粉酶活性，酶活最高為44.8 U，比對照組提高了34.94%；而0.40 T的磁處理水可顯著提高其多酚氧化酶及蛋白酶的活性，并且提前其蛋白酶高峰出現(xiàn)的時間，其多酚氧化酶最高為23.0 U，相比對照組提高了1675%，蛋白酶活性最高為68.1 U，相比對照組提高了38.98%。

研究結(jié)果表明，不同場強和方式處理的磁化水均促進(jìn)了蛹蟲草菌絲的生長和活性物質(zhì)的積累。在0.40 T處理組中，其菌絲干重和蟲草酸含量分別提高了27.12%、22.93%，025 T處理組中蟲草素含量提高了16.49%，多糖含量提高了1832%。這與張敬宇等[14，16，18]研究結(jié)果相似。

胞外酶活性與活性物質(zhì)含量相關(guān)性分析顯示，胞外蛋白酶活性與菌絲干重、蟲草酸含量及蟲草素含量呈顯著相關(guān)（P<0.1），與多糖含量呈一定程度的負(fù)相關(guān)（P=0.387），胞外淀粉酶活性與多糖含量呈正相關(guān)（P=0.262）。胞外多酚氧化酶活性與菌絲干重、蟲草酸含量和蟲草素含量呈正相關(guān)（P=0.161、P=0.124、P=0.115、P=0.235）。這說明利用不同磁理水深層發(fā)酵蛹蟲草，胞外淀粉酶活性與多糖含量具有一定相關(guān)性，而胞外蛋白酶活性與菌絲干重、蟲草酸及蟲草素含量關(guān)系密切，為關(guān)鍵因子。這從另一角度上也說明，在蛹蟲草液體培養(yǎng)過程中，胞外蛋白酶活性對蛹蟲草菌絲的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這與陳方順等[34]研究結(jié)果相似。

此外，研究中0.25 T處理組蟲草素含量均高于0.10 T和0.40 T處理組。這說明磁效應(yīng)對生物的影響與磁場強度并非一定呈線性相關(guān)。同時，不同磁化水均能促進(jìn)蛹蟲草蟲草酸和多糖的積累，但二者含量隨磁場強度的變化趨勢相反。這與前期研究生物磁效應(yīng)對蛹蟲草子座生物學(xué)效率、活性物質(zhì)含量影響結(jié)果相一致[35]。從生物磁效應(yīng)的機理角度分析，這可能是由于生物磁效應(yīng)的閾值效應(yīng)、負(fù)效應(yīng)、滯后效應(yīng)以及菌株自身生理特點共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。從真菌生理角度分析，這可能是由于磁處理水引發(fā)了一系列生理生化變化，導(dǎo)致二者在生理代謝過程中，競爭某種或某類底物引起的，也可能是磁處理水特異地促進(jìn)或抑制了與二者代謝相關(guān)密切的某類特異性的酶活性引起的，但這必然與蛹蟲草胞外蛋白酶關(guān)系十分密切，具體機理仍有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] KIRK P M，CANNON P F，DAVID J C，et al.Ainsworth Bisby′s Dictionary of the Fungi[M].Wallingford，UK：CABI Publishing，2001.

[2] 中國科學(xué)院中國孢子植物志編輯委員會.中國真菌志：第三十二卷，蟲草屬[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[3] JOHNS D G，ADAMSON R H.Enhancement of the biological activity of cordycepin （3′deoxyadenosine） by the adenosine deaminase inhibitor 2′deoxycoformycin[J].Biochemical Pharmacology，2006，25（12）：1441-1444.

[4] YU R，SONG L，ZHAO Y，et al.Isolation and biological properties of polysaccharide CPS1 from cultured Cordyceps militaris[J].Fitoterapia，2004，75（5）：465-472.

[5] KHAN M A，TANIA M，ZHANG D，et al.Cordyceps mushroom：A potent anticancer nutraceutical[J].The Open Nutraceuticals Journal，2010，3：179-183.

[6] NAN J X，PARK E J，YANG B K，et al.Antibiotic effect of extracellular biopolymer from submerged mycelial cultures of Cordyceps militaris on liver fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats[J].Archives of Pharmacal Research，2001，24（4）：327-332.

[7] SHIH I L，TSAI K L，HSIEH C.Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris[J].Biochemical Engineering Journal，2007，33（3）：193-201.

[8] AHN Y J，PARK S J，LEE S G，et al.Cordycepin：selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordycceps militaris against Clostridium spp.[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48：2744-2748.

[9] JUNG K，KIM I H，HAN D.Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity in mice[J].Journal of Ethnopharmacology，2004，93（1）：75-81.

[10] CHOI S B，PARK C H，CHOI M K，et al.Improvement of insulin resistance and insulin secretion by water extracts of Cordyceps militaris，Phellinus linteus，and Paecilomyces tenuipes in 90% pancreatectomized rats[J].Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2004，68（11）：2257-2264.

[11] WON S Y，PARK E H.Antiinflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris[J].Journal of Ethnopharmacology，2005，96（3）：555-561.

[12] LIN Y W，CHIANG B H.Antitumor activity of the fermentation broth of Cordyceps militaris cultured in the medium of Radix astragali[J].Process Biochemistry，2008，43（3）：244-250.

[13] 程功.生物磁效應(yīng)對杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)及胞外酶的作用[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2007.

[14] 張敬宇.磁化水在黑木耳生產(chǎn)上的應(yīng)用效果[J].食用菌，1995（3）：34.

[15] 張福元，王友平，姚滿生，等.磁化水對醋糟栽培平菇菌絲生長及產(chǎn)量的影響[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，12（2）：146-148.

[16] 劉銀春，尤華明.噴澆磁水的靈芝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化[J].福建林學(xué)院學(xué)報，2001，21（3）：220-223.

[17] 林健.生物磁化水對培養(yǎng)杏鮑菇、香菇的影響及營養(yǎng)品質(zhì)分析[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2009.

[18] 劉作喜，劉恩舉，趙華.磁場處理對香菇菌的生長影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，25（2）：88-89.

[19] PARK J P，KIM Y M，KIM S W，et al.Effect of aeration rate on the mycelial morphology and exobiopolymer production in Cordyceps militaris[J].Process Biochemistry，2002，37（11）：1257-1262.

[20]王玉萬，王云.構(gòu)菌栽培過程中對木質(zhì)纖維素的降解和幾種多糖分解酶的活性變化[J].微生物學(xué)通報，1989，16（3）：137-189.

[21] LOWRY O H，ROSBROUGH N J，F(xiàn)ARR A L，et al.Protein measurement with the folin phenolreagent[J].The Journal of Biological Chemistry，1951，193（1）：265-275.

[22]曾榮鑒.碳源和氮源對平菇菌絲胞外酶的誘導(dǎo)作用[J].食用菌，1992（1）：17-18.

[23] KIHO T，TABATA H，UKAI S，et al.A minor，proteincontaining galactomannan from a sodium carbonate extract of Cordyceps sinensis[J].Carbohydr Res，1986，156：189-196.

[24] 雷捷.北蟲草子實體最佳培養(yǎng)條件探索及其有效成分的檢測方法的優(yōu)化[D].長春：吉林大學(xué)，2004.

[25] 薛俊杰，唐慶九，劉艷芳.蛹蟲草水溶性多糖含量測定方法的比較與優(yōu)化[J].菌物學(xué)報，2012，31（3）：443-448.

[26] HSIEH C，TSAI M J，HSU T H，et al.Medium optimization for polysaccharide production of Cordyceps sinensis[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2005，120：145-157.

[27] 楊東生.北蟲草菌株誘變選育、固體栽培條件優(yōu)化及粗多糖活性研究[D].長春：吉林大學(xué)，2011.

[28] 李國棟.生物磁現(xiàn)象和效應(yīng)的機制及理論[J].河北師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1995，19（5）：183-186.

[29] FRANCEHETTI G.Elcetromagnetic Biointeraction Mechanisms Safety Standards，Protection GuidesCourse Proceedings [M].Kluwer Academic Plenum Publishers，1989.

[30] 袁林.生物電和生物磁的原理及其臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)裝備，2005，2（10）：35-37.

[31] 毛寧.生物磁技術(shù)在工農(nóng)業(yè)的應(yīng)用及其機理探討[J].激光生物學(xué)報，1998，7（4）：306-309.

[32] 朱元保，顏流水，曹祉祥，等，磁化水的物理化學(xué)性能[J].湖南大學(xué)學(xué)報，1999，26（1）：22-33.

[33] 李娟.金頂側(cè)耳不同生長期幾種胞外酶活性變化[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2007.

[34] 陳方順，于青，林麗仙，等.木屑栽培香菇胞外纖維素酶和磷酸二脂酶活性的變化[J].食用菌學(xué)報，1999，6（3）：8-12.

[35] 趙博，張國財，林連男，等.生物磁效應(yīng)對蛹蟲草生物活性物質(zhì)含量的影響[J].植物研究，2013，33（4）：508-511.