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        轉(zhuǎn)甜味蛋白Brazzein基因乳腺特異表達(dá)載體的山羊體細(xì)胞株篩選

        2014-04-29 00:00:00王春生等
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年24期

        摘要[目的] 建立通過山羊乳汁獲取甜味蛋白Brazzein的方法。[方法]將前期工作中構(gòu)建的Brazzein基因山羊乳腺特異表達(dá)載體STPpBC1進(jìn)行線性化,采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞,以期獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞。[結(jié)果] 采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞后,通過最適G418濃度(400 μg/ml)篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞;轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)梭形且核仁清晰,其生長曲線呈現(xiàn)正常的“S”;轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞經(jīng)冷凍復(fù)蘇后,仍呈現(xiàn)與冷凍前新鮮轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相似的形態(tài)和生長曲線;PCR鑒定結(jié)果表明 ,STPpBC1已整合入轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基因組中。[結(jié)論] 成功獲得乳腺特異的轉(zhuǎn)甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纖維細(xì)胞株。

        關(guān)鍵詞山羊;乳腺特異表達(dá)載體;Brazzein基因;轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

        中圖分類號S827文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2014)24-08099-03

        The Screening and Identification of Transgenic Goat Fibroblast Cells with Sweet Protein Brazzein Gene

        WANG Chunsheng, AN Tiezhu et al (College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

        Abstract [Objective] In order to obtain transgenic goat fibroblast cells with sweet protein Brazzein gene. [Method] Goat fibroblast cells were transfected with mammary gland specific expression vector STPpBC1 constructed in the previous work by cationic liposome method and cultured G418resistant cell. After PCR identified, transgenic cell line with Tem was established. The G418 positive cells were detected. [Result] Transgenic cell could be obtained by the optimum concentration of G418. Morphology of the transgenic cell and transgenic cells after freezingthawing was similar with normal mammary epithelial cells, the cell growth curve was “S” shape, PCR results showed that the vector constructed was integrated into genome. [Conclusion] The transgenic cells with temporinGFP were filtrated, and lay the foundation for the transgenic goat with expression temporin in mammary.

        Key words Goat; Mammary gland specific expression vector; Brazzein gene; Transgenic cell

        甜味蛋白Brazzein是西非野生植物Pentadiplandra brazzeana外果皮和種子之間形成的一種蛋白,具有極高的與糖類相似甜味,但其含量僅為果實(shí)干重的0.02%~005%[1]。因此,通過植物難以獲得大量的Brazzein蛋白。如果采用轉(zhuǎn)基因的方法,就能通過動物等生物反應(yīng)器獲取大量的Brazzein蛋白。為了通過山羊乳汁獲取Brazzein蛋白,筆者利用前期工作[2]中構(gòu)建的山羊乳腺特異Brazzein基因真核表達(dá)轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞,以期獲得轉(zhuǎn)Brazzein基因陽性細(xì)胞株,為建立通過體細(xì)胞移植方法培育乳腺特異表達(dá)Brazzein的山羊奠定基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1山羊皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)采取約10日齡幼山羊耳廓皮膚組織,采用常規(guī)方法,用CO2培養(yǎng)箱(38 ℃、5%CO2、100%濕度),以DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液原代培養(yǎng)山羊皮膚成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行3~4代的傳代培養(yǎng)。

        1.2最適G418濃度的篩選用分別含有1 000、800、600、400、200、100 和50 μg/μl G418 的DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液培養(yǎng)“1.1”中傳代培養(yǎng)的山羊皮膚成纖維細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞存活狀態(tài),確定篩選陽性細(xì)胞的最佳G418濃度。

        1.3Brazzein基因真核表達(dá)載體的線性化在前期工作[2]中已獲得山羊乳腺特異表達(dá)Brazzein基因的真核表達(dá)載體,即根據(jù)GenBank中甜味蛋白Brazzein基因的mRNA序列(A95587),人工合成Brazzein基因pUC57質(zhì)粒(命名為STpUC57);以ST pUC57質(zhì)粒作為模板,TP1(5′GTCGACATGGCTAAGTTTGCTTCT3′)和TP2(5′GTCGACTTAGTATTCGCAGTAATC3′)為引物,利用rTaq DNA Polymerase進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增,對目的條帶進(jìn)行膠回收,并連接到pMD18Simple載體上,獲得被命名為STPpMD18Simple的表達(dá)載體;利用Sal1酶對STPpMD18Simple進(jìn)行單酶雙酶切,并用Gel Extraction Kit膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收,獲得甜味蛋白Brazzein基因片段;用Xho1酶單酶切乳腺特性載體pBC1獲得線性化乳腺特性載體pBC1載體;Brazzein基因和線性化的山羊乳腺特異性pBC1載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化后,獲得乳腺特異的Brazzein基因真核表達(dá)載體(命名為STPpBC1)。將STPpBC1利用NotI酶進(jìn)行單酶切后進(jìn)行線性化。

        1.4山羊皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將“1.1”中傳代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞,用無抗生素的DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%~70%后,根據(jù)脂質(zhì)體Lipofect Transfect Reagen(Tiangen)說明,用上述線性化的STPpBC1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

        1.5轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的篩選將“1.4”中用線性化STPpBC1轉(zhuǎn)染的山羊成纖維細(xì)胞,在含有“1.3”中篩選的G418 濃度的DMEM( 含10%胎牛血清) 溶液中培養(yǎng),在倒置顯微鏡下,每隔24 h 觀察細(xì)胞形態(tài)和存活狀態(tài),當(dāng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡后,再用含G418 的培養(yǎng)液繼續(xù)篩選7 d,最后用無G418 的培養(yǎng)液傳代培養(yǎng),觀察計(jì)算并繪制細(xì)胞生長曲線( 每個時間點(diǎn)設(shè)3個重復(fù))。

        1.6轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的生物學(xué)特性在倒置顯微鏡下,觀察轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞形態(tài),并檢測其細(xì)胞的生長特性;采用常規(guī)方法將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行冷凍復(fù)蘇后,觀察其細(xì)胞形態(tài),并通過對其續(xù)培養(yǎng)觀察其生長特點(diǎn)。

        1.7轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的PCR 鑒定分別提取山羊成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)STPpBC1的山羊成纖維細(xì)胞基因組,以ST1與ST2為特異性引物進(jìn)行PCR 鑒定,檢測2種細(xì)胞基因組中目的基因的整合情況。PCR 反應(yīng)體系為25 μl,其中,基因組DNA 2.0 μl(100 ng),dNTP(2.5 mmol/L)1.0 μl,10×rTaq Buffer 2.5 μl,ST1和ST2引物各1.0 μl,rTaq酶0.25 μl,水 17.25 μl。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃30 s,55.6 ℃30 s,72 ℃30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

        2結(jié)果與分析

        2.1傳代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞形態(tài)利用山羊耳廓皮膚組織原代培養(yǎng)其成纖維細(xì)胞,在培養(yǎng)后的第3天,組織懸浮塊周邊出現(xiàn)梭形游離的細(xì)胞(圖1),其細(xì)胞的核仁清晰,并開始逐漸貼壁,進(jìn)入指數(shù)期;在培養(yǎng)后第7天,細(xì)胞貼壁生長達(dá)到80%~90%匯合;當(dāng)將原代培養(yǎng)山羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時,在培養(yǎng)后的第4天,細(xì)胞可達(dá)80%匯合(圖2)。

        圖1原代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞(100×)圖2傳代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞(100×)2.2篩選轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的最適G418濃度采用“1.3”方法篩選最適G418濃度,結(jié)果表明,與添加其他濃度的G418相比,當(dāng)添加G418的濃度為400 μg/ml時,第9天細(xì)胞全部死亡,以此確定G418的最適濃度為400 μg/ml(圖3)。

        圖3篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的最適G418濃度2.3轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞形態(tài)及其生長特性將線性化的STPpBC1轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞并經(jīng)G418篩選,對篩選的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)。在續(xù)培養(yǎng)后第3天,在倒置熒光顯微鏡下,其細(xì)胞能夠呈現(xiàn)出與原代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞相似的梭形,且核仁清晰;在續(xù)培養(yǎng)后的第7天,細(xì)胞間隔逐漸消失,呈梭形貼壁生長(圖4);轉(zhuǎn)STPpBC1 的山羊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)生長曲線(圖5) 顯示,開始培養(yǎng)后的前3 d生長緩慢,且數(shù)量少于對照組,第4~6天細(xì)胞較快增殖,第7天后細(xì)胞數(shù)量變化趨于平緩,細(xì)胞生長曲線呈S形,符合細(xì)胞生長的生物學(xué)規(guī)律。

        圖4轉(zhuǎn)基因山羊成纖維細(xì)胞細(xì)胞(100×)圖5轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長曲線2.4經(jīng)冷凍復(fù)蘇的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞形態(tài)及其生長特性將冷凍保存的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,經(jīng)復(fù)蘇后進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)。在續(xù)培養(yǎng)后第24 h,細(xì)胞開始貼壁生長,其細(xì)胞形態(tài)呈梭形(圖6)。經(jīng)續(xù)培養(yǎng)后的第96 h,細(xì)胞達(dá)到約80%匯合;與未經(jīng)冷凍的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相似,經(jīng)冷凍復(fù)蘇的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞曲線呈S形,符合細(xì)胞生長的生物學(xué)規(guī)律(圖7)。

        圖6經(jīng)冷凍復(fù)蘇的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞圖7經(jīng)冷凍復(fù)蘇的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長曲線2.5轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的PCR檢測收集經(jīng)轉(zhuǎn)染STPpBC1,且利用含G418 的培養(yǎng)基篩選具有正常增殖能力的山羊成纖維細(xì)胞后,提取基因組DNA,并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示,2 處理組均可擴(kuò)增出目的條帶,與陽性對照(STPpBC1)擴(kuò)增條帶大小一致,陰性對照(正常山羊基因組DNA) 未擴(kuò)增出條帶(圖8)。

        注:1.陰性對照;2.D2000plus Marker;3、4.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞;5.陽性對照。

        圖8轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的PCR鑒定3討論

        目前,已發(fā)現(xiàn)具有甜味的主要蛋白有Miraculin[3](存在于非洲西部植物Richadella dulcifera)、Curculin[4](存在于仙矛植物)、Thaumatin[5](存在于西非植物Thaumatococcus daniellii)、Monellin[6](存在于熱帶植物Dioscoreophyllum cumminsii)、Mabinlin[7](存在于我國云南植物Capparis masaikai)和Brazzein[8](存在于西非野生的植物Pentadiplandra brazzeana),其中,由于Brazzein甜度高達(dá)相同質(zhì)量蔗糖的2 000倍[9]而備受關(guān)注。

        一般情況下,具有甜味蛋白的植物對其生長所需條件苛刻,且在其干物質(zhì)中甜味蛋白的含量甚微[10]。為此,人們探索了采用轉(zhuǎn)基因方法,通過馬鈴薯和煙草表達(dá)Thaumatin蛋白[11],通過大腸桿菌以及枯草芽孢桿菌[12]和畢赤酵母[13]表達(dá)Brazzein蛋白等方法,但未能獲得理想的效果。

        大量研究證實(shí),選擇組織特異性啟動子與外源目的基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體并通過轉(zhuǎn)基因方法能使外源基因在機(jī)體特異組織中表達(dá)。目前,利用乳腺細(xì)胞的特異性啟動子和外源基因構(gòu)建的表達(dá)載體,分別獲得乳腺特異表達(dá)β-酪蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠[14]、表達(dá)α1antitrypsin(抗胰蛋白酶)的綿羊[15]等。此外,隨著體細(xì)胞克隆技術(shù)的不斷完善,體細(xì)胞克隆效率不斷提高,獲得體細(xì)胞克隆動物的種類和數(shù)量不斷增加。自SCHNIEKE等[16]首次以轉(zhuǎn)染外源DNA的綿羊成纖維細(xì)胞為核供體,通過細(xì)胞核移植方法成功獲得了轉(zhuǎn)基因綿羊以來,利用該方法已相繼獲得轉(zhuǎn)基因牛[17]、豬[18]和山羊[19]。上述結(jié)果表明,將利用組織特異性啟動子和外源基因構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體細(xì)胞后,通過體細(xì)胞核移植方法,就能獲得組織特異表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。

        迄今為止尚未見到有關(guān)甜味蛋白基因在動物乳腺中表達(dá)的相關(guān)報道。為了建立甜味蛋白基因Brazzein在山羊乳腺中表達(dá)的方法,該研究利用前期工作中構(gòu)建的山羊乳腺特異表達(dá)載體STPpB(Brazzein)C1,經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞(圖1、2),并通過最適G418濃度400 μg/ml(圖3)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞篩選,結(jié)果表明,獲得細(xì)胞形態(tài)和生長曲線正常(圖4、5)的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞;經(jīng)冷凍復(fù)蘇后,轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞仍呈現(xiàn)正常形態(tài)和生長特性;PCR鑒定結(jié)果表明,STPpBC1已整合到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基因組中。上述結(jié)果表明,該研究成功獲得乳腺特異的轉(zhuǎn)甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纖維細(xì)胞株。能否利用該細(xì)胞通過體細(xì)胞核移植的方法獲得乳腺特異表達(dá)甜味蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊有待于進(jìn)一步探討。

        42卷24期王春生等轉(zhuǎn)甜味蛋白Brazzein基因乳腺特異表達(dá)載體的山羊體細(xì)胞株篩選參考文獻(xiàn)

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