摘要：固定化酶技術(shù)是酶工程的核心，該技術(shù)使酶反應(yīng)的連續(xù)生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)，簡(jiǎn)化了下游分離純化步驟，利于實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用及產(chǎn)物與酶的分離。隨著固定化酶技術(shù)的發(fā)展，共固定化酶也受到越來越多的關(guān)注，已被廣泛應(yīng)用于食品、生物和醫(yī)藥等領(lǐng)域。本文介紹了共固定化酶的共固定方法，對(duì)近年來共固定化酶在食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：共固定化酶 食品 方法

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1672-5336（2014）22-0071-03

固定化酶技術(shù)是指借助固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)利用的技術(shù)。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)在于其不僅具有與游離酶一樣的高校專一性與溫和的催化性能外，經(jīng)固定化后酶的穩(wěn)定性通常都會(huì)得到提高，且固定化酶可重復(fù)利用，操作連續(xù)可控，大大節(jié)約了成本。

共固定化酶是將兩種或兩種以上的酶同時(shí)固定于同一載體內(nèi)形成的固定化酶。共固定化酶技術(shù)始于20世紀(jì)80年代，其綜合了混合催化和固定化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可將不同酶的催化特性結(jié)合起來，充分利用了酶之間的協(xié)同作用，提高了酶的催化效率，同時(shí)可以減少反應(yīng)的時(shí)間和步驟，將多步催化簡(jiǎn)化為一步催化，利于連化生產(chǎn)，有利于降低生產(chǎn)成本。

1 共固定化酶的方法

1.1 載體結(jié)合法

載體結(jié)合法是通過物理或化學(xué)方法，將酶結(jié)合到非水溶性的載體上，主要有共價(jià)結(jié)合法、離子結(jié)合法和物理吸附法三種。常用的字體有殼聚糖、纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、硅藻土、活性炭、氧化鋁、多孔玻璃等。顧旭炯等[1]將糖化酶和α-淀粉酶采用物理吸附法共固定于硅藻土上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化后雙酶具有一定的協(xié)同作用，且具有較好的熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和操作的連續(xù)性。Ozyilmaz，G.等[2]研究了將葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶采用共價(jià)結(jié)合的方式共固定于硅酸鎂上，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共固定化酶可以大大提高這兩種酶的活性和重復(fù)使用率。

1.2 包埋法

包埋法是將酶包裹于凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)使酶固定。一般適合于底物為小分子物質(zhì)的酶的固定，因?yàn)榇蠓肿拥孜锘虍a(chǎn)物不能通過載體的網(wǎng)絡(luò)。常用載體有海藻酸鈉、明膠、纖維素、卡拉膠等。Frank A等[3]研究了海藻酸鈉包埋法共固定葡聚糖酶和葡聚糖蔗糖酶的工藝，將該共固定化酶用于水解蔗糖制備低聚異麥芽糖有較高的得率。

1.3 交聯(lián)法

交聯(lián)法是采用雙功能或多功能試劑進(jìn)行酶分子之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能團(tuán)試劑或多功能團(tuán)試劑之間形成共價(jià)鍵，得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).現(xiàn)有技術(shù)中通常是將交聯(lián)與載體結(jié)合法、包埋等方法相結(jié)合使用。江南大學(xué)[4]的發(fā)明專利中將乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶采用包埋-交聯(lián)的方法共固定于載體海藻酸鈉上，交聯(lián)劑為戊二醛，載體也可以為明膠或卡拉膠。

1.4 其它方法

南京師范大學(xué)[5]的發(fā)明專利中公開了采用基因工程技術(shù)制備了共固定化木聚糖降解酶，通過基因重組技術(shù)將木聚糖降解酶帶上一個(gè)在高溫下結(jié)合力強(qiáng)的高效穩(wěn)定的親和標(biāo)簽后進(jìn)行共表達(dá)，然后與固定化載體材料特異結(jié)合從而構(gòu)建一個(gè)基因工程共固定化木聚糖降解酶用于秸稈木聚糖底物制備低聚木糖和木糖，達(dá)到系列木聚糖降解酶之間的協(xié)同作用。李丕武等[6]將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶共固定在磁性生物活性玻璃微球上，制備得到的固定化酶在連休使用10次后酶活性仍保持在原來的67.3%。

2 共固定化酶在食品中的應(yīng)用研究

2.1 共固定化酶在糖類生產(chǎn)中的應(yīng)用

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于共固定化酶制備糖類產(chǎn)品的研究較多集中在低聚糖、果糖、葡萄糖的生產(chǎn)方面。江南大學(xué)[4]的發(fā)明專利中公開了采用乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化酶催化乳糖連續(xù)化生產(chǎn)乳果糖的方法。與單獨(dú)固定化一種酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶在制備乳果糖的過程中更能發(fā)揮兩種酶之間的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)底物和產(chǎn)物的一步轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少。山西天驕?zhǔn)硺I(yè)有限公司[7]的發(fā)明專利中公開了將定點(diǎn)突變的葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶采用吸附-交聯(lián)的方法共固定于載體雙酚A環(huán)氧乙烯基酯樹脂上，交聯(lián)劑為戊二醛，并將其作用于紅棗汁催化生產(chǎn)阿洛酮糖。將兩種酶共固定在同一載體上，兩種不同酶的特性充分發(fā)揮并相互結(jié)合，排除測(cè)定底物中的干擾因素，從而利用酶的系統(tǒng)效應(yīng)，減小了傳質(zhì)距離，縮短了底物的傳遞時(shí)間，提高了雙酶體系的效率和使用周期，有利于產(chǎn)物的分離提取，降低了生產(chǎn)成本，使催化效率高于單一固定化酶和混合固定化酶。ǒlcer等[8]人研究了將葡聚糖酶和葡聚蔗糖酶共固定在海藻酸鈉的珠、纖維和膠囊上來制備共固定化酶，并將其用于低聚異麥芽糖的生產(chǎn)。通過優(yōu)化共固定化條件得到的共固定酶固定化率達(dá)到71%，并且具有較高的轉(zhuǎn)化活力。AjoyC[9]等人研究了淀粉葡萄苷酶和支鏈酶的共固定化及用于葡萄糖的生產(chǎn)，采用親水聚氨基甲酸酯泡沫為載體，共固定化作用于淀粉生產(chǎn)葡萄糖的得率較單固定的淀粉葡萄苷酶相比提高了1.6倍。Frank A等[3]對(duì)海藻酸鈉包埋法共固定葡聚糖酶和葡聚糖蔗糖酶的工藝進(jìn)行了研究，并將該共固定化酶用于水解蔗糖來制備低聚異麥芽糖，共固定化酶生產(chǎn)低聚異麥芽糖的產(chǎn)率較單固定化葡聚糖蔗糖酶相比提高了2-20倍。

2.2 共固定化酶在肽、氨基酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

酶法水解蛋白質(zhì)為肽和氨基酸生產(chǎn)的主要方法，功能性肽和氨基酸因其具有的優(yōu)良的保健功效，因此廣泛應(yīng)用于食品、保健品等的制備中。南昌大學(xué)[10]的發(fā)明專利中公開了以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶中任意兩種酶組成復(fù)合蛋白酶，共固定于載體海藻酸鈉上，并將其用于水解魚鱗蛋白來制備魚鱗多肽。該發(fā)明中雙酶共固定化體系擁有固定化酶的高穩(wěn)定性和連續(xù)操作能力，又具有多酶的協(xié)同作用，因此其酶解效率高。高明俠等[11]對(duì)共固定化雙酶水解芝麻粕蛋白制備復(fù)合氨基酸進(jìn)行了研究，以海藻酸鈉為載體、戊二醛為交聯(lián)劑共固定化木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，將制得的共固定化酶用于水解芝麻粕蛋白來制備復(fù)合氨基酸。

2.3 共固定化酶在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

國(guó)內(nèi)外關(guān)于共固定化酶在生物傳感器方面的應(yīng)用較多，主要集中在醫(yī)藥涉及的檢測(cè)方面，在食品中的應(yīng)用不多。干寧等[12]研究了利用氣相沉積方法在玻碳電極表面得到二氧化鈦凝膠膜，并在電極表面同時(shí)固定5-核苷酸酶（5c-NT） 和辣根過氧化物酶（HRP），構(gòu)建了一種新型快速測(cè)定肌苷酸（IMP）含量的安培傳感電極，并將其用于雞肉中肌苷酸的在線檢測(cè)。

2.4 共固定化酶在食品工業(yè)中的其它應(yīng)用

共固定化酶在食品中其它方面研究主要涉及的是化合物的酶法生產(chǎn)、產(chǎn)品品質(zhì)改良等。如北京化工大學(xué)[13]的發(fā)明專利中公開了以氨基化的PGMA微球?yàn)檩d體共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，并將共固定化酶應(yīng)用于生產(chǎn)葡萄糖酸或其鹽。杭州益民化工有限公司[14]的發(fā)明專利中公開了共固定化漆酶和葡萄糖氧化酶作用于粗品茶皂素，對(duì)其進(jìn)行脫色。該發(fā)明具有反應(yīng)條件溫和，脫色時(shí)間短，脫色效果顯著的優(yōu)點(diǎn)。Sisak等[15]利用陰離子交換樹脂Amberlite UP 900對(duì)葡萄糖氧化酶及過氧化氫酶進(jìn)行共固定，并設(shè)計(jì)了反應(yīng)器用于去除雞蛋清中的葡萄糖.蘇二正等[16]研究了共固定化單寧酶和β-葡萄糖苷酶對(duì)茶飲料增香和除混效果，經(jīng)過共固定化酶的處理，綠茶、紅茶、烏龍茶3類茶的香精油總量均有所增加，香氣得到了改善。經(jīng)共固定化酶處理后的綠茶飲料的濁度也較未處理的要低，經(jīng)過3個(gè)月貯藏后，經(jīng)共固定化酶處理綠茶的澄清度一直很高，未經(jīng)共固定化酶處理的綠茶在60天后有少許沉淀產(chǎn)生。

3 展望

共固定化酶可以充分發(fā)揮酶之間的協(xié)同作用，具有反應(yīng)步驟少，作用時(shí)間短，催化效率高，可連續(xù)化生產(chǎn)等多種優(yōu)點(diǎn)，用于工業(yè)化生產(chǎn)可降低生產(chǎn)成本。但目前大部分研究還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并未進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，未來對(duì)于共固定化酶的研究依然是固定化酶的一個(gè)重要研究方向，開發(fā)新的載體，研發(fā)可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的共固定化酶將是共固定化酶的研究重點(diǎn)，共固定化酶的應(yīng)用前景也將更加廣闊。

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