摘要：三聚氰胺事件是近年來關(guān)乎食品安全的主要事件之一，本論文研究了納米金粒子比色法檢測三聚氰胺的新方法，采用檸檬酸鈉法制備20nm納米金粒子，將納米金粒子加入牛奶中，通過紫外特征吸收峰的偏移，使用分光光度計(jì)定量檢測牛奶中的三聚氰胺含量，在0.5-10ppm內(nèi)有良好的線性（吸光值范圍為0.8-2.5），該方法操作簡單、反應(yīng)快速，且檢測靈敏度高，是鮮乳三聚氰胺檢測的一種新方法。

關(guān)鍵詞：牛奶 三聚氰胺 納米金粒子

中圖分類號：TS252.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）22-0036-03

食品安全問題一直是關(guān)系國計(jì)民生的重要社會問題，國家質(zhì)檢總局于2008年10月批準(zhǔn)了三聚氰胺的檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[1，2]，三聚氰胺是三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，白色晶體，其含氮量達(dá)到66.7%，是一種產(chǎn)用的化工原料被廣泛的應(yīng)用于滅火器、建材、皮革紡織和造紙等行業(yè)[3，4]，長期服用會產(chǎn)生蓄積毒性，主要表現(xiàn)為以腎結(jié)石、尿道結(jié)石和膀胱結(jié)石為主的腎損傷。因此本實(shí)驗(yàn)通過納米金粒子使三聚氰胺溶液由酒紅色變?yōu)樽仙蛩{(lán)色的這一現(xiàn)象來對三聚氰胺進(jìn)行定性定量分析，本實(shí)驗(yàn)擬制備納米金粒子，利用分光光度法分析不同含量的三聚氰胺的牛奶顏色的變化，從而達(dá)到大批量快速檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器

1.1.1 原料

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1.1.2 試劑

三聚氰胺，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；四氯金酸，分析純，上海化工有限公司；DNA Oligomers（聚胸腺嘧啶，T5，T10，T20），優(yōu)級純，寶生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米金粒子的制備

采用Frens的檸檬酸鈉還原法[1]制備，首先配制100ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的四氯金酸溶液，加入圓底燒瓶中，攪拌，密封條件下進(jìn)行冷凝回流，直至四氯金酸溶液沸騰，接著加入1.95ml 1%的檸檬酸鈉溶液，密閉加熱并攪拌，四氯金酸溶液的顏色由淡黃色變?yōu)闇\灰，深灰和黑色，最終變成酒紅色。即制備得到納米金粒子。

1.2.2 樣品制備

配制三聚氰胺含量范圍為0.5023-10.2635mg/kg的牛奶樣品共10個(gè)樣品，樣品混勻后，在40℃水浴鍋中加熱10min，備用。

1.2.3 新鮮牛奶的預(yù)處理

將12.8ml的新鮮牛奶與20ml的高純水溶于100ml燒杯中，然后加入5.6ml三氯乙酸和8ml的三氯甲烷，超聲10min，將混合液在10000rpm條件下離心10min，取上清液中和pH值至7.0，過1000Da的微孔濾膜，濾過后的清液備用。

1.2.4 三聚氰胺的檢測方法

將0.9ml的納米金粒子溶液與16.5μL的PBS緩沖溶液混合，之后加入6μL的Tn，混勻，然后加入含有三聚氰胺的牛奶處理樣品，充分混勻后使用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zeta電位和粒度分析

本論文制備的納米金粒子的Zeta電位為-32mv，粒徑分布在22nm左右，單分散性較好。三聚氰胺帶正電荷，納米金粒子與三聚氰胺之間通過靜電相互作用而相互吸引，使納米金粒子發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，因此，納米金粒子-三聚氰胺的Zeta電位為-11.25mv，粒度分布達(dá)到1000nm左右。

2.2 最佳pH值的確定

通過圖1可以看出，pH值越高，納米金粒子表面的檸檬酸上的羧基的電離度越高，與三聚氰胺的氨基之間的靜電作用增強(qiáng)，因此Aλ700/λ520不斷增大。但是，當(dāng)pH值偏堿性時(shí)，三聚氰胺的氨基的電離增強(qiáng)，與納米金粒子表面的靜電作用減弱，Aλ700/λ520降低，因此，本實(shí)驗(yàn)的最佳pH值為7.0。

2.3 最佳濃度的確定

Aλ700/λ520隨著納米金粒子濃度的升高先增加后降低，當(dāng)濃度較大時(shí)，即降低了與納米金結(jié)合的三聚氰胺數(shù)量，因此檢測效果降低。由圖2可以看出，當(dāng)納米金粒子的濃度為0.06g/L時(shí)，吸光度值達(dá)到最大值，檢測效果最好，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳納米金粒子濃度為0.06g/L。

2.4 最佳DNA鏈長的確定

DNA的鏈長會直接影響納米金粒子與三聚氰胺的結(jié)合程度，因此，選擇最佳DNA鏈長在本實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要。本論文選擇了T5，T10，T20即分別含有5，10和20個(gè)堿基的DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在相同的條件下，發(fā)現(xiàn)DNA鏈長對檢測吸光度有一定的影響，見圖3，當(dāng)三聚氰胺濃度在40μmol/L以下時(shí)，三種鏈長的DNA檢測效果相近，但是，隨著三聚氰胺濃度的升高，T10的檢測效果明顯優(yōu)于其他，因此選擇最佳DNA為T10。

3 結(jié)語

通過檸檬酸鈉法制備的納米金粒子的平均粒徑為20nm左右，當(dāng)納米金粒子與含有三聚氰胺的新鮮牛奶溶液混合后，三聚氰胺改變了納米金粒子表面的等離子共振體，其特征吸收光譜發(fā)生了偏移，故可以通過添加納米金的方法對三聚氰胺進(jìn)行定量檢測，并且三聚氰胺含量在0.5-10ppm內(nèi)有良好的線性，該方法操作簡單、反應(yīng)快速，且檢測靈敏度高，是鮮乳中三聚氰胺檢測的一種新方法。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》，2008.10.

[2] （中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)管理委員會中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T22400—2008《原料乳中三聚氰胺快速檢測2液相色譜法》，2008.10.

[3]Liu J D， Liu J J， Yuan J H， et al. Proteome of melamine urinary bladder stones and implication for stone formation [J].Toxicology Letters， 2012，212： 307-314.

[4]Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J].Nature Physical Science，1973，241：20-22.