摘要：應(yīng)用高效液相色譜儀，以亞鐵氰化鉀-乙酸鋅作為蛋白質(zhì)沉淀劑，以乙腈作為三聚氰胺的提取劑進(jìn)行簡(jiǎn)單提取，以強(qiáng)陽離子交換色譜柱進(jìn)行分離，高效液相色譜紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，建立一種奶糖中三聚氰胺的快速檢測(cè)方法。方法簡(jiǎn)便，具有較高的精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度，可用于奶糖中三聚氰胺的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：奶糖 三聚氰胺 高效液相色譜 簡(jiǎn)便 快速

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）22-0020-03

2007年，美國(guó)食品藥物管理局召開新聞發(fā)布會(huì)，宣稱經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從中國(guó)進(jìn)口的寵物食品原料玉米蛋白粉和谷朊粉中檢測(cè)出三聚氰胺。而用這些原料生產(chǎn)的寵物食品，是導(dǎo)致食用它的貓、狗出現(xiàn)中毒患病、死亡的主要原因。然而，這個(gè)當(dāng)時(shí)被國(guó)際上稱為寵物“毒糧”的事件，并沒有在國(guó)內(nèi)得到廣泛的關(guān)注。直到2008年，因食用含有三聚氰胺的嬰幼兒乳粉，而導(dǎo)致國(guó)內(nèi)很多省份的嬰幼兒出現(xiàn)泌尿系統(tǒng)疾病，甚至引發(fā)急性腎衰的“毒奶粉”事件，才使國(guó)內(nèi)的民眾真正了解了三聚氰胺。這一事件，不僅嚴(yán)重?fù)p害了廣大消費(fèi)者的利益，也導(dǎo)致了中國(guó)的整個(gè)乳品行業(yè)乃至食品加工產(chǎn)業(yè)再次出現(xiàn)了誠(chéng)信危機(jī)。

三聚氰胺（英文melamine）分子式C3N6H6，俗稱蛋白精，可微溶于水，幾乎無味，是一種含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，屬于尿素的后加工產(chǎn)品。通常情況下，三聚氰胺只能作為一種工業(yè)原料，用于塑料樹脂的生產(chǎn)加工，不得在食品加工生產(chǎn)中添加。而一些不法廠商把三聚氰胺添加到食品中，是因?yàn)樵谌矍璋贩肿又泻?6.7%的氮元素，這些氮元素被折算成粗蛋白的含量高達(dá)416.27%。而目前國(guó)標(biāo)規(guī)定的檢測(cè)食品中蛋白質(zhì)含量的方法——?jiǎng)P氏定氮法是通過檢測(cè)食品中的“氮”，從而計(jì)算出蛋白質(zhì)含量的。這種檢測(cè)方法區(qū)分不了氮元素是來源于食品中的蛋白質(zhì)分子還是人為添加的三聚氰胺的氮雜環(huán)。所以，為了降低食品成本，一些不法廠商把三聚氰胺這種低廉的化工原料，添加到食品中用以提高食品的蛋白質(zhì)含量。

奶糖是人們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常食用的一種休閑食品，近年來由于個(gè)別廠商為了降低成本，以添加三聚氰胺的乳粉為原料生產(chǎn)奶糖，在奶糖中檢測(cè)中三聚氰胺的事件也時(shí)有發(fā)生。為了保障消費(fèi)者的安全食用，檢測(cè)其三聚氰胺含量具有十分重要的意義。文獻(xiàn)中報(bào)道的三聚氰胺的檢測(cè)方法有很多種，但針對(duì)于奶糖這種基質(zhì)的樣品的專門的檢測(cè)方法未見報(bào)道。本文研究了奶糖中的三聚氰胺的檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便、快速、易操作，為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)奶糖中的三聚氰胺提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)原理

以亞鐵氰化鉀-乙酸鋅作為奶糖中蛋白質(zhì)的沉淀劑，以乙腈作為奶糖中三聚氰胺的提取劑，以強(qiáng)陽離子交換色譜柱進(jìn)行分離，高效液相色譜紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

2 試劑和材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

（1）乙腈（CH3CN）：色譜純。

（2）磷酸（H3PO4）。

（3）磷酸二氫鉀（KH2PO4）。

（4）冰醋酸（CH3COOH）。

（5）亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]。

（6）乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]。

（7）微孔濾膜：水相，0.45μm。

（8）針式過濾器：有機(jī)相，0.45μm。

（9）一次性注射器：2mL。

（10）具塞刻度離心管：50mL。

（11）亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）：稱取106.0g亞鐵氰化鉀（2.5），用水溶解，并稀釋至1000 mL。

（12）乙酸鋅溶液（220g/L）：稱取220.0g乙酸鋅（2.6），先加30mL冰醋酸（2.4）溶解，用水稀釋至1000 mL。

（13）磷酸鹽緩沖溶液（0.05mol/L）：稱取6.8g（精確至0.01g）磷酸二氫鉀 （2.3），加水800mL完全溶解后，用磷酸（2.2）調(diào)節(jié)pH值至3.0，用水稀釋至1L，經(jīng)濾膜（2.7）過濾后備用。

（14）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C3H6N6）：CAS108-78-01純度大于99.0%。

（15）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100mg（精確至0.1mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2.14），用水完全溶解后，在100mL容量瓶中定容至刻度，混勻，4℃條件下避光保存，有效期為1個(gè)月。

（16）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液：將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.15）逐級(jí)用水稀釋，得到濃度為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

3 儀器和設(shè)備

（1）高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測(cè)器；美國(guó)安捷倫科技有限公司LC1100型。

（2）高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠LG10-2.4DB型。

（3）數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司KQ-250DB型。

（4）旋渦混合器：上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠XW-80A。

（5）電子分析天平：感量0.0001g；島津公司AW320型。

（6）電子分析天平：感量0.01g；常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

4 測(cè)定步驟

4.1 試樣的制備

稱取混合均勻的10g（精確至0.01g）奶糖試樣，置于50mL具塞刻度離心管（2.10）中，加入20mL乙腈（2.1），渦旋混勻，超聲提取10min，再振搖提取10min后，加入5.0mL亞鐵氰化鉀溶液（2.11）和5.0mL乙酸鋅溶液（2.12），用乙腈（2.1）定容至50mL， 充分混合均勻后靜置5min，以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，用一次性注射器（2.9）吸取上清液用針式過濾器（2.8）過濾后，作為高效液相色譜分析用試樣。

4.2 高效液相色譜測(cè)定

4.2.1 色譜條件

（1）色譜柱：強(qiáng)陽離子交換色譜柱Luna 5μm， SCX 100A，250mm×4.6mm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。

（2）流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液（3.2.11）-乙腈（70+30，體積比），混勻。

（3）流速：1.0mL/min。

（4）柱溫：30℃。

（5）檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm。

（6）進(jìn)樣量：10μL。

4.2.2 儀器的準(zhǔn)備

開機(jī)，用流動(dòng)相平衡色譜柱，待基線穩(wěn)定后開始進(jìn)樣。

4.2.3 定性分析

根據(jù)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間，確定奶糖中的三聚氰胺的色譜峰。

4.2.4 定量分析

將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（2.16）濃度由低到高分別進(jìn)樣檢測(cè)，可測(cè)得不同濃度的三聚氰胺的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將待測(cè)試樣（4.1）分別進(jìn)樣，測(cè)得目標(biāo)峰峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)試樣中三聚氰胺含量。

待測(cè)樣品中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍的應(yīng)適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行進(jìn)樣分析。

5 工作曲線和檢出限

將濃度為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液，在4.2.1的色譜條件下分別進(jìn)樣檢測(cè)分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，三聚氰胺在濃度0～6.0μg/mL范圍內(nèi)于峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為A=144.17747c-0.580383，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。按3倍信噪比計(jì)算，方法檢出限為0.05mg/kg。

6 精密度和加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別在不含三聚氰胺的奶糖空白樣品中加入標(biāo)樣，應(yīng)用本方法測(cè)定六次，精密度試驗(yàn)和加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可見，用該方法測(cè)定結(jié)果的RSD值，即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%～2.26%，加標(biāo)回收率為88.5%～93.0%，表明該法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

7 關(guān)鍵技術(shù)

7.1 色譜條件的選擇

因?yàn)槿矍璋肥且环N強(qiáng)極性化合物，其分子式中含有的銨根使它在反相鍵合相上保留值非常低，接近于死時(shí)間流出，所以在傳統(tǒng)的反相C8色譜柱和C18色譜柱上幾乎不能進(jìn)行分析。這樣就需要在流動(dòng)相中添加一定量的離子對(duì)試劑加，使樣品離子與添加的離子對(duì)結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)，才能進(jìn)行分析。而如果在流動(dòng)相中添加了離子對(duì)試劑，則色譜的基線噪音與漂移比較嚴(yán)重，需要2～4h的平衡時(shí)間，才能使儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。本方法用強(qiáng)陽離子交換色譜柱進(jìn)行分離，僅用0.5～1h，儀器就可以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，使樣品的檢驗(yàn)時(shí)間大大縮短，而且分離效果良好，基線噪音小，靈敏度高。

7.2 提取條件的選擇

提取奶糖中的三聚氰胺時(shí)，分別用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液和磺基水楊酸溶液進(jìn)行試驗(yàn)，觀察樣品中蛋白質(zhì)的沉淀效果。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用使用磺基水楊酸溶液，在三聚氰胺峰的前面有一個(gè)很明顯的干擾峰，而且干擾峰的峰面積隨著樣品中蛋白質(zhì)含量的變化而改變，通過多次加標(biāo)試驗(yàn)驗(yàn)證，這是乳品中含有的一個(gè)組分在此位置出峰?？梢?，采用這種提取條件，三聚氰胺峰與樣品的干擾峰與幾乎重疊，干擾峰的保留時(shí)間和標(biāo)樣保留時(shí)間非常接近，峰形也非常好，操作人員很容易將該成分誤判成三聚氰胺。而在試驗(yàn)中使用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液，在三聚氰胺處沒有干擾，既可以有效的沉淀奶糖中的蛋白質(zhì)，又能得到較高的回收率。

8 結(jié)語

以亞鐵氰化鉀-乙酸鋅作為蛋白質(zhì)沉淀劑，以乙腈作為三聚氰胺的提取劑進(jìn)行簡(jiǎn)單提取，以強(qiáng)陽離子交換色譜柱進(jìn)行分離，高效液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)奶糖中的三聚氰胺，方法快速簡(jiǎn)便，具有較高的精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度，可用于奶糖中三聚氰胺的快速檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]王延吉.有機(jī)化工原料[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[2]馮建民，吉俊紅.中國(guó)三聚氰胺生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)技術(shù)分析.化工科技市場(chǎng)[J]，2006.

[3]邵靜君，溫嘉琪，徐世文.三聚氰胺毒理學(xué)研究進(jìn)展.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)[J]，2007.

[3]鄭玲，李麗華，覃偼，傅華.高效液相色譜法測(cè)定腐竹中的三聚氰胺[J]，2009.

[5]GB/T22388-2008.原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法.2008.

[6]GB/T22400-2008.原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法.2008.