摘要：

目的：觀(guān)察中藥仙鶴復(fù)方水提取物（aqueous extract of Xian-he Compound，XHC）對(duì)肝癌H22細(xì)胞增殖與凋亡的影響及對(duì)炎癥因子COX-2的影響。方法：采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)不同濃度的H22 肝癌細(xì)胞增殖情況；Hoechst 33342染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；western blot檢測(cè)COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)COX-2mRNA水平表達(dá)的變化。結(jié)果：XHC各劑量組較空白對(duì)照組對(duì)肝癌H22細(xì)胞均有明顯的抑制作用，以作用24h后的1.8g/mLXHC組作用最顯著，抑制率為71.25%±0.32%；與空白對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)后加1.8g/mLXHC組有較顯著的凋亡率，凋亡率由1.91%±0.45%增加至8.53%±0.13%；同樣作用條件下與空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組相比COX-2蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論：XHC的抑瘤作用與下調(diào)COX-2蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：中藥仙鶴復(fù)方水提取物；肝癌H22細(xì)胞株；COX-2

To study the antitumor mechanism of aqueous extract of Xian-he compound

to H22 hepatoma cells transplanted murine Xue-wen Yuan 1 Yu-jie Chen 1 Xiao-yan Zhang2 Hui-qin Huang 1 （1.The pharmacy department of Third People's Hospital of Huizhou，2. The pharmacy department of He-nan-an Hospital of Huizhou， Huizhou， Guangdong 516000）

Abstract：

Objective： To investigate the effect of XHC on the proliferation and apoptosis as well as the expression to H22 hepatoma cells in vitro.Methods： The inhibitory effect of different conc entrations of XHC on H22 cells was examined by methyl thiazolyl tetrazo lium（ MTT） assay； the H22 cell apoptosis after each test is analysed by Hoechst 33342 staining； the expression of COX protein and mRNA was determined by western blot and RT-PCR individually.Results： each dose group of XHC compared with the control group can significantly inhibit the proliferation of H22 cells，specially，the 1.8g/mLXHC group after 24h is the best at 71.25% ± 0.32%. and also， the LPS-induced plus 1.8g/mLXHC group had more significant apoptosis rate from 1.91% ± 0.45% to 8.53% ± 0.13%； at this conditions， the expression of COX-2 protein and mRNA was significantly reduced compared with the control group and positive group.Conclusion：The XHC has a better anti-tumor effect in animals， which may be closely related with the COX-2.

Key words：XHC； H22 hepatoma cell line； COX-2

【中圖分類(lèi)號(hào)】

R28 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）06-0150-02

中藥仙鶴復(fù)方為臨床經(jīng)驗(yàn)方化裁而成。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為由于人體正氣內(nèi)虛，臟腑功能失調(diào)，以致邪毒乘虛而入，蘊(yùn)及于經(jīng)絡(luò)臟腑，使得機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，氣血功能障礙，導(dǎo)致氣滯，血瘀，痰凝，毒聚相互結(jié)交的一系列病理變化，日久而形成腫瘤。本方由仙鶴草、白花蛇舌草、白英和甘草組成，具有清熱解毒，攻堅(jiān)散結(jié)、祛瘀止痛功效，主治因氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而導(dǎo)致的各種實(shí)體瘤，尤其對(duì)肝癌、胃癌、宮頸癌等效果尤佳。單藥研究結(jié)果：百花蛇舌草提取物抑制H22實(shí)驗(yàn)性小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能是通過(guò)增強(qiáng)Bax同時(shí)降低Bak的表達(dá)，并通過(guò)非caspase依賴(lài)的apoptosis-inducing factor （AIF）信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[1]。仙鶴草可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[2]；白英體通過(guò)調(diào)控Bcl-2，Bax、Survivin、caspase-3或?qū)δ[瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[3][4]；甘草通過(guò)調(diào)節(jié)ERK-1/2信號(hào)通路下調(diào)PMA誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)或是抑制依賴(lài)COX-2的PGE2的表達(dá)來(lái)干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5][6]，研究結(jié)果均表明，單藥具有抗腫瘤作用。大量研究結(jié)果表明COX-2在大多數(shù)正常細(xì)胞中不表達(dá)，只參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和凋亡的病理過(guò)程，同時(shí)也與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤新生血管的形成關(guān)系密切；因此，本研究主要考察中藥仙鶴復(fù)方水提取物對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)制的探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：（1）主要試劑：中藥仙鶴復(fù)方原料購(gòu)自惠州市衛(wèi)康醫(yī)藥有限公司，我院藥劑科中藥師鑒別確認(rèn)，其水提取物由珠海市聯(lián)邦醫(yī)藥有限公司GMP實(shí)驗(yàn)室提供（要求每毫升相當(dāng)于3.60g生藥藥液），并再分別稀釋成1.80g/ml和0.9g/ml，共3種溶液。置4℃冰箱備用。胰蛋白酶、Trizol、尼美舒利（nimesulide，NS）及二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；Hoechst33342購(gòu)自鼎國(guó)生物工程公司；（2）H22肝癌細(xì)胞株由天津藥物研究院提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞生長(zhǎng)在含100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為37℃、5%CO2和95%的空氣，每2-3 天傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。肝癌細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：用培養(yǎng)液將細(xì)胞制成2×108/L細(xì)胞混懸液，接種于96孔板，每孔200μL，24小時(shí)后隨機(jī)分為4組：分別加入終濃度為0、0.9g/ml、1.80g/ml和3.60g/ml中藥仙鶴復(fù)方水提取物的培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；分別作用24、48、72h后每孔加新配置的0.5%MTT貯存液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液后每孔加150μlDMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。抑制率（%）=（對(duì)照孔A490-試驗(yàn)孔A490）/對(duì)照孔490×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀(guān)察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌H22細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種于放置有無(wú)菌蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2mL，5%CO2、9 5%濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將細(xì)胞隨機(jī)分4組：空白對(duì)照組、脂多糖（LPS）誘導(dǎo)組（LPS100mg/L）、LPS +中藥復(fù)方仙鶴復(fù)方水提取物作用組（LPS100mg/L+中藥仙鶴復(fù)方水提取物1.80g/mL）、LPS+NS對(duì)照組（LPS100mg/L+NS300mg/L）進(jìn)行試驗(yàn)。作用24h 后取出一張細(xì)胞爬片，制備細(xì)胞爬片，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，用5mg/LHoechst33342染液室溫下對(duì)爬片細(xì)胞染色15min，熒光顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)算凋亡率。

1.5 COX-2 mRNA測(cè)定：細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照4，作用24 h后收集細(xì)胞，以Trizol試劑抽提RNA.用DNA/RNA測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和純度，取2μg總RNA，加入Oligo （dt） 20引物及高敏感逆轉(zhuǎn)錄酶Rever Tra Dash TM（均為北京康為世紀(jì)產(chǎn)品），在25μL體積下，行下列熱處理： 30℃，10 min；42℃， 20 min；95℃，3 min； 4℃， 5 min；最后瞬間離心.完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng). COX-2引物序列為：上游5’-CAATCTGGCTGAGGGAACACAACA-3’，下游5’-ATCTGCCTGCTCTGGTCAATGGA-3’；β-actin引物序列為：上游5’-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAG-GA-3’，下游5’-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3’，均由上海生物工程公司合成.反應(yīng)條件為：98℃， 10 s； 60℃，2 s； 74℃，30 s，32個(gè)循環(huán)。 COX-2， β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為342 bp和580 bp. 20g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用MUVB220凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描，以COX-2與β-actin的比值作為COX-2 mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

1.6 Western blot：細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照4，作用24 h后收集細(xì)胞，用 PBS 洗滌 3 次，加入細(xì)胞裂解液后，冰上裂解15min，隨后吸出裂解物置于1ml離心管于4℃，10 000轉(zhuǎn)/分離心10min，小心吸出上清液，用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取提取的蛋白質(zhì)樣品 （20μg總蛋白量/泳道） 加入適量4×上樣緩沖液和 10% β-巰基乙醇，100℃煮 10min，6%或10% SDS-PAGE電泳 （積層膠80 V，分離膠120V） 后電轉(zhuǎn)移 （220mA 1.5h） 至 PVDF 膜上，麗春紅染色觀(guān)察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。5%脫脂牛奶室溫封閉 4h，加入1∶1000COX-2一抗或者1∶400 β-actin一抗（均購(gòu)置武漢博士德）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10min。加入 1∶1000 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育 2h，TBST洗5次，每次5min。用 Western 印跡熒光檢測(cè)試劑盒顯示于X光片。結(jié)果用 Labwork 凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 XHC對(duì)腫瘤H22細(xì)胞增殖的影響：與空白對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照相比，不同濃度XHC（0.9g/mL，1.8mg/L，3.6mg/L） 對(duì)腫瘤H22細(xì)胞體外生長(zhǎng)均有抑制作用，但細(xì)胞抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)（ 24，48，72h ） 沒(méi)有明顯增加，每組重復(fù)3次，（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的XHC對(duì)腫瘤H22細(xì)胞增殖的影響

2.2 Hoechst 33342熒光染色細(xì)胞凋亡的觀(guān)察：熒光顯微鏡下，中藥仙鶴復(fù)方水提取物作用組和 NS對(duì)照組可見(jiàn)核濃染呈亮藍(lán)色、核染色質(zhì)凝集及邊緣化的細(xì)胞，并可見(jiàn)凋亡小體，而其余各組細(xì)胞胞質(zhì)及胞核呈均一濃染的藍(lán)色。每視野計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，各組重復(fù)3次，計(jì)算出平均凋亡率，結(jié)果與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均<0.05。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Hoechst 33342熒光染色細(xì)胞凋亡

2.3 XHC對(duì)H22細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)的影響：從圖二A圖可知，各組在作用24h后，空白對(duì)照組即有COX-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，LPS +中藥仙鶴復(fù)方水提取物組與單純LPS誘導(dǎo)及空白對(duì)照組的H22細(xì)胞可有效下調(diào)COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）； 從B圖可知，各組在作用24h后，空白對(duì)照組即有COX-2mRNA的表達(dá)，LPS +中藥仙鶴復(fù)方水提取物組與單純LPS誘導(dǎo)及空白對(duì)照組的H22細(xì)胞可有效下調(diào)COX-2mRNA表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）圖二 Western blot及RT-PCR檢測(cè)H22細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)： A，Western blot 檢測(cè)H22細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)。分四組：A：正常對(duì)照組 B：LPS組C：LPS +中藥仙鶴復(fù)方水提取物組；D：LPS +尼美舒利組；B，RT-PCR檢測(cè)H22細(xì)胞COX-2mRNA的表達(dá).分組同上。

3 討論

COX-2是前列腺素（prostaglandins， PGs）合成過(guò)程中的重要限速酶，本文研究發(fā)現(xiàn)COX-2在腫瘤組織中有較高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)相對(duì)較低；同時(shí)相關(guān)文獻(xiàn)[7]發(fā)現(xiàn)COX-2的啟動(dòng)子序列中含有NF-κB特異結(jié)合序列，該序列與NF-κB結(jié)合后可以促進(jìn)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄；而NF-κB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，在未受刺激時(shí)，它的二聚體與抑制性蛋白IκB結(jié)合，形成NF-κB/IκB復(fù)合物，存在于胞質(zhì)中；當(dāng)外源性刺激通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活I(lǐng)κB激酶（IKK）上游的激酶而使IKK活化，活化的IKK再使其底物IκB磷酸化，并進(jìn)一步降解，NF-κB發(fā)生核異位，與靶基因的特異位點(diǎn)相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。IKK/IκB/NF-κB途徑各成員的異常有可能影響NF-κB的組成性活化，使NF-κB呈高水平誘導(dǎo)性活化，這些都在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色，因此本課題接下來(lái)的任務(wù)是探討中藥仙鶴復(fù)方水提取物如何通過(guò)對(duì)IKK/IκB/NF-κB途徑各成員的最用達(dá)到抗腫瘤作用。

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