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        中藥仙鶴復(fù)方水提取物對(duì)肝癌H22細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其作用機(jī)制

        2014-04-29 00:00:00袁學(xué)陳毓杰張小燕黃慧青
        藥物與人 2014年6期

        摘要:

        目的:觀(guān)察中藥仙鶴復(fù)方水提取物(aqueous extract of Xian-he Compound,XHC)對(duì)肝癌H22細(xì)胞增殖與凋亡的影響及對(duì)炎癥因子COX-2的影響。方法:采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度的H22 肝癌細(xì)胞增殖情況;Hoechst 33342染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;western blot檢測(cè)COX-2蛋白質(zhì)表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)COX-2mRNA水平表達(dá)的變化。結(jié)果:XHC各劑量組較空白對(duì)照組對(duì)肝癌H22細(xì)胞均有明顯的抑制作用,以作用24h后的1.8g/mLXHC組作用最顯著,抑制率為71.25%±0.32%;與空白對(duì)照組相比,LPS誘導(dǎo)后加1.8g/mLXHC組有較顯著的凋亡率,凋亡率由1.91%±0.45%增加至8.53%±0.13%;同樣作用條件下與空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組相比COX-2蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論:XHC的抑瘤作用與下調(diào)COX-2蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)有密切關(guān)系。

        關(guān)鍵詞:中藥仙鶴復(fù)方水提取物;肝癌H22細(xì)胞株;COX-2

        To study the antitumor mechanism of aqueous extract of Xian-he compound

        to H22 hepatoma cells transplanted murine Xue-wen Yuan 1 Yu-jie Chen 1 Xiao-yan Zhang2 Hui-qin Huang 1 (1.The pharmacy department of Third People's Hospital of Huizhou,2. The pharmacy department of He-nan-an Hospital of Huizhou, Huizhou, Guangdong 516000)

        Abstract:

        Objective: To investigate the effect of XHC on the proliferation and apoptosis as well as the expression to H22 hepatoma cells in vitro.Methods: The inhibitory effect of different conc entrations of XHC on H22 cells was examined by methyl thiazolyl tetrazo lium( MTT) assay; the H22 cell apoptosis after each test is analysed by Hoechst 33342 staining; the expression of COX protein and mRNA was determined by western blot and RT-PCR individually.Results: each dose group of XHC compared with the control group can significantly inhibit the proliferation of H22 cells,specially,the 1.8g/mLXHC group after 24h is the best at 71.25% ± 0.32%. and also, the LPS-induced plus 1.8g/mLXHC group had more significant apoptosis rate from 1.91% ± 0.45% to 8.53% ± 0.13%; at this conditions, the expression of COX-2 protein and mRNA was significantly reduced compared with the control group and positive group.Conclusion:The XHC has a better anti-tumor effect in animals, which may be closely related with the COX-2.

        Key words:XHC; H22 hepatoma cell line; COX-2

        【中圖分類(lèi)號(hào)】

        R28 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763(2014)06-0150-02

        中藥仙鶴復(fù)方為臨床經(jīng)驗(yàn)方化裁而成。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為由于人體正氣內(nèi)虛,臟腑功能失調(diào),以致邪毒乘虛而入,蘊(yùn)及于經(jīng)絡(luò)臟腑,使得機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào),氣血功能障礙,導(dǎo)致氣滯,血瘀,痰凝,毒聚相互結(jié)交的一系列病理變化,日久而形成腫瘤。本方由仙鶴草、白花蛇舌草、白英和甘草組成,具有清熱解毒,攻堅(jiān)散結(jié)、祛瘀止痛功效,主治因氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而導(dǎo)致的各種實(shí)體瘤,尤其對(duì)肝癌、胃癌、宮頸癌等效果尤佳。單藥研究結(jié)果:百花蛇舌草提取物抑制H22實(shí)驗(yàn)性小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),可能是通過(guò)增強(qiáng)Bax同時(shí)降低Bak的表達(dá),并通過(guò)非caspase依賴(lài)的apoptosis-inducing factor (AIF)信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[1]。仙鶴草可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[2];白英體通過(guò)調(diào)控Bcl-2,Bax、Survivin、caspase-3或?qū)δ[瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用[3][4];甘草通過(guò)調(diào)節(jié)ERK-1/2信號(hào)通路下調(diào)PMA誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)或是抑制依賴(lài)COX-2的PGE2的表達(dá)來(lái)干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5][6],研究結(jié)果均表明,單藥具有抗腫瘤作用。大量研究結(jié)果表明COX-2在大多數(shù)正常細(xì)胞中不表達(dá),只參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和凋亡的病理過(guò)程,同時(shí)也與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤新生血管的形成關(guān)系密切;因此,本研究主要考察中藥仙鶴復(fù)方水提取物對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)制的探討。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料:(1)主要試劑:中藥仙鶴復(fù)方原料購(gòu)自惠州市衛(wèi)康醫(yī)藥有限公司,我院藥劑科中藥師鑒別確認(rèn),其水提取物由珠海市聯(lián)邦醫(yī)藥有限公司GMP實(shí)驗(yàn)室提供(要求每毫升相當(dāng)于3.60g生藥藥液),并再分別稀釋成1.80g/ml和0.9g/ml,共3種溶液。置4℃冰箱備用。胰蛋白酶、Trizol、尼美舒利(nimesulide,NS)及二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司;Hoechst33342購(gòu)自鼎國(guó)生物工程公司;(2)H22肝癌細(xì)胞株由天津藥物研究院提供。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞生長(zhǎng)在含100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱內(nèi)條件為37℃、5%CO2和95%的空氣,每2-3 天傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。肝癌細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

        1.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況:用培養(yǎng)液將細(xì)胞制成2×108/L細(xì)胞混懸液,接種于96孔板,每孔200μL,24小時(shí)后隨機(jī)分為4組:分別加入終濃度為0、0.9g/ml、1.80g/ml和3.60g/ml中藥仙鶴復(fù)方水提取物的培養(yǎng)液,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔;分別作用24、48、72h后每孔加新配置的0.5%MTT貯存液20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清液后每孔加150μlDMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶,用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。抑制率(%)=(對(duì)照孔A490-試驗(yàn)孔A490)/對(duì)照孔490×100%。

        1.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀(guān)察:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌H22細(xì)胞,胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL,將細(xì)胞懸液接種于放置有無(wú)菌蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔2mL,5%CO2、9 5%濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,將細(xì)胞隨機(jī)分4組:空白對(duì)照組、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)組(LPS100mg/L)、LPS +中藥復(fù)方仙鶴復(fù)方水提取物作用組(LPS100mg/L+中藥仙鶴復(fù)方水提取物1.80g/mL)、LPS+NS對(duì)照組(LPS100mg/L+NS300mg/L)進(jìn)行試驗(yàn)。作用24h 后取出一張細(xì)胞爬片,制備細(xì)胞爬片,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,用5mg/LHoechst33342染液室溫下對(duì)爬片細(xì)胞染色15min,熒光顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)算凋亡率。

        1.5 COX-2 mRNA測(cè)定:細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照4,作用24 h后收集細(xì)胞,以Trizol試劑抽提RNA.用DNA/RNA測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和純度,取2μg總RNA,加入Oligo (dt) 20引物及高敏感逆轉(zhuǎn)錄酶Rever Tra Dash TM(均為北京康為世紀(jì)產(chǎn)品),在25μL體積下,行下列熱處理: 30℃,10 min;42℃, 20 min;95℃,3 min; 4℃, 5 min;最后瞬間離心.完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng). COX-2引物序列為:上游5’-CAATCTGGCTGAGGGAACACAACA-3’,下游5’-ATCTGCCTGCTCTGGTCAATGGA-3’;β-actin引物序列為:上游5’-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAG-GA-3’,下游5’-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3’,均由上海生物工程公司合成.反應(yīng)條件為:98℃, 10 s; 60℃,2 s; 74℃,30 s,32個(gè)循環(huán)。 COX-2, β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為342 bp和580 bp. 20g/L瓊脂糖凝膠電泳,利用MUVB220凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描,以COX-2與β-actin的比值作為COX-2 mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

        1.6 Western blot:細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照4,作用24 h后收集細(xì)胞,用 PBS 洗滌 3 次,加入細(xì)胞裂解液后,冰上裂解15min,隨后吸出裂解物置于1ml離心管于4℃,10 000轉(zhuǎn)/分離心10min,小心吸出上清液,用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取提取的蛋白質(zhì)樣品 (20μg總蛋白量/泳道) 加入適量4×上樣緩沖液和 10% β-巰基乙醇,100℃煮 10min,6%或10% SDS-PAGE電泳 (積層膠80 V,分離膠120V) 后電轉(zhuǎn)移 (220mA 1.5h) 至 PVDF 膜上,麗春紅染色觀(guān)察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。5%脫脂牛奶室溫封閉 4h,加入1∶1000COX-2一抗或者1∶400 β-actin一抗(均購(gòu)置武漢博士德)4℃孵育過(guò)夜,TBST洗3次,每次10min。加入 1∶1000 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育 2h,TBST洗5次,每次5min。用 Western 印跡熒光檢測(cè)試劑盒顯示于X光片。結(jié)果用 Labwork 凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描,以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和半定量分析。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 XHC對(duì)腫瘤H22細(xì)胞增殖的影響:與空白對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照相比,不同濃度XHC(0.9g/mL,1.8mg/L,3.6mg/L) 對(duì)腫瘤H22細(xì)胞體外生長(zhǎng)均有抑制作用,但細(xì)胞抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)( 24,48,72h ) 沒(méi)有明顯增加,每組重復(fù)3次,(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 不同濃度的XHC對(duì)腫瘤H22細(xì)胞增殖的影響

        2.2 Hoechst 33342熒光染色細(xì)胞凋亡的觀(guān)察:熒光顯微鏡下,中藥仙鶴復(fù)方水提取物作用組和 NS對(duì)照組可見(jiàn)核濃染呈亮藍(lán)色、核染色質(zhì)凝集及邊緣化的細(xì)胞,并可見(jiàn)凋亡小體,而其余各組細(xì)胞胞質(zhì)及胞核呈均一濃染的藍(lán)色。每視野計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,各組重復(fù)3次,計(jì)算出平均凋亡率,結(jié)果與正常組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均<0.05。結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 Hoechst 33342熒光染色細(xì)胞凋亡

        2.3 XHC對(duì)H22細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)的影響:從圖二A圖可知,各組在作用24h后,空白對(duì)照組即有COX-2蛋白質(zhì)的表達(dá),LPS +中藥仙鶴復(fù)方水提取物組與單純LPS誘導(dǎo)及空白對(duì)照組的H22細(xì)胞可有效下調(diào)COX-2蛋白質(zhì)表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05); 從B圖可知,各組在作用24h后,空白對(duì)照組即有COX-2mRNA的表達(dá),LPS +中藥仙鶴復(fù)方水提取物組與單純LPS誘導(dǎo)及空白對(duì)照組的H22細(xì)胞可有效下調(diào)COX-2mRNA表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)圖二 Western blot及RT-PCR檢測(cè)H22細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá): A,Western blot 檢測(cè)H22細(xì)胞COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)。分四組:A:正常對(duì)照組 B:LPS組C:LPS +中藥仙鶴復(fù)方水提取物組;D:LPS +尼美舒利組;B,RT-PCR檢測(cè)H22細(xì)胞COX-2mRNA的表達(dá).分組同上。

        3 討論

        COX-2是前列腺素(prostaglandins, PGs)合成過(guò)程中的重要限速酶,本文研究發(fā)現(xiàn)COX-2在腫瘤組織中有較高表達(dá),而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)相對(duì)較低;同時(shí)相關(guān)文獻(xiàn)[7]發(fā)現(xiàn)COX-2的啟動(dòng)子序列中含有NF-κB特異結(jié)合序列,該序列與NF-κB結(jié)合后可以促進(jìn)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄;而NF-κB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子,在未受刺激時(shí),它的二聚體與抑制性蛋白IκB結(jié)合,形成NF-κB/IκB復(fù)合物,存在于胞質(zhì)中;當(dāng)外源性刺激通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活I(lǐng)κB激酶(IKK)上游的激酶而使IKK活化,活化的IKK再使其底物IκB磷酸化,并進(jìn)一步降解,NF-κB發(fā)生核異位,與靶基因的特異位點(diǎn)相結(jié)合,從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。IKK/IκB/NF-κB途徑各成員的異常有可能影響NF-κB的組成性活化,使NF-κB呈高水平誘導(dǎo)性活化,這些都在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色,因此本課題接下來(lái)的任務(wù)是探討中藥仙鶴復(fù)方水提取物如何通過(guò)對(duì)IKK/IκB/NF-κB途徑各成員的最用達(dá)到抗腫瘤作用。

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