摘要：

目的：對(duì)依替巴肽注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行探討，建立其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：按《中國(guó)藥典2010》二部附錄Ⅺ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行。結(jié)果：在驗(yàn)證條件下，依替巴肽注射液可以采用稀釋方法排除干擾。結(jié)論：可以采用此法對(duì)本品的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查。

關(guān)鍵詞：依替巴肽注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素方法；驗(yàn)證

Research of Bacterial Endotoxin Method for Eptifibatide Injection

JIN Aimin， WANG Chunling， WANG Cuiling， LI Qin， HU Chunyong （Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang， Jiangsu， 222000）

Abstract：

Objective： Research and establish bacterial endotoxin method for Eptifibatide Injection. Method： Test according to Appendix XI E test for bacterial endotoxin in the 2010 Edition of Chinese Pharmacopeia Volume II. Result： Under validation conditions， the dilution method can be used to eliminate the interference in the test of Eptifibatide Injection. Conclusion： This method can be used to test the bacterial endotoxin in Eptifibatide Injection.

Key words： Eptifibatide Injection， Bacterial Endotoxin Method， Validation

【中圖分類(lèi)號(hào)】

R453 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）06-0047-02

急性冠脈綜合癥（Acute coronary syndromes，ACS）是血小板功能過(guò)度激活而產(chǎn)生的血栓性事件。根據(jù)臨床癥狀主要分為不穩(wěn)定型心絞痛（Unstable angina pectoris，UAP）、非ST段抬高心梗死（Non-ST-elevation myocardial infarction，NSTEMI）及ST段抬高心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction，STEMI）[1-3]。冠狀動(dòng)脈血管斑塊破裂或血管內(nèi)皮被侵蝕而引起的血栓栓塞是促發(fā)ACS的主要原因，可發(fā)生于多個(gè)部位。由于ACS發(fā)病急，并且導(dǎo)致病情不穩(wěn)定因素多，導(dǎo)致此病較難控制，現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響人類(lèi)生存質(zhì)量的疾病之一[4]。依替巴肽為特異性GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，通過(guò)與血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，占據(jù)了其上的結(jié)合位點(diǎn)，使血小板GPⅡb/Ⅲa受體不能與纖維蛋白原結(jié)合，從而抑制了血小板聚集。由于依替巴肽阻滯了血小板聚集的最后共同途徑，具有抗血小板作用強(qiáng)、起效快、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)依替巴肽注射液的研究，可滿足國(guó)內(nèi)急性冠脈綜合癥狀病人的需要，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白，具有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目[5]，本品為注射劑按照中國(guó)藥典2010版附錄ⅠB[6]的要求，為了更加有效的保障患者用藥安全，本品要進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Ms3digital旋渦混合器，CJ-2F凈化工作臺(tái)，DK-600S電熱恒溫水槽，DMH-1電熱干燥箱。

1.1.2 試劑：鱟試劑1【規(guī)格0.06EU/ml（0.1ml/支）批號(hào)11080611】福州新北生化工業(yè)有限公司；鱟試劑2【規(guī)格0.06EU/ml（0.1ml/支）批號(hào)1110122】湛江海洋生物制品有限公司；鱟試驗(yàn)用水【50ml/支批號(hào)11010305】福州新北生化工業(yè)有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品【規(guī)格180EU/支批號(hào)150601-200965】中國(guó)藥品生物制品檢定所；pH調(diào)節(jié)劑【規(guī)格2ml/支批號(hào)110904】福州新北生化工業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備：所有容器、用具都必須經(jīng)過(guò)處理，去除外源性內(nèi)毒素，玻璃儀器于250℃干烤至少1小時(shí)，塑料用具須確證不干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。操作過(guò)程中避免微生物污染。初次使用的鱟試劑必須經(jīng)過(guò)靈敏度復(fù)核[7]。通過(guò)測(cè)評(píng)及計(jì)算依替巴肽注射液（100ml：75mg）的細(xì)菌內(nèi)毒素限值暫定為L(zhǎng)<0.5EU/mg。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核： 按《中國(guó)藥典》2010版二部附錄Ⅺ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核，二批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查λc與λ一致（應(yīng)在0.5λ≤λc≤2λ范圍內(nèi)），結(jié)果均符合規(guī)定。

1.2.3 依替巴肽注射液（10ml：20mg、100ml：75mg）對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)

1.2.3.1 干擾預(yù)試驗(yàn)（鱟試劑：λ=0.06EU/ml）：取本品，加BET水進(jìn)行供試品溶液（NPC）和供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液（PPC）的配制。

1.2.3.1.1 供試品溶液（NPC）配制：取三個(gè)批號(hào)的供試品（100ml：75mg），BET水及pH調(diào)節(jié)劑制備成38.mg/ml、18.75mg/ml、9.375mg/ml、6.25mg/ml共四個(gè)濃度。

1.2.3.1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋方法：用1ml的鱟試驗(yàn)用水溶解1支細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，用旋渦混合器連續(xù)混合15分鐘，成150EU/ml，用鱟試驗(yàn)用水稀釋成4λ、2λ，在進(jìn)行下一步稀釋前，至少混和30秒。

1.2.3.1.3 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液（PPC）的配制：配制的濃度同上，每個(gè)濃度中含2λ（0.125EU/ml）的細(xì)菌內(nèi)毒素，制備成38.mg/ml+2λ、18.75mg/ml+2λ、9.375mg/ml+2λ、6.25mg/ml+2λ共四個(gè)濃度。

1.2.3.1.4 試驗(yàn)過(guò)程： 取上述二個(gè)廠家的鱟試劑各64支，先分別加入0.1mlBET水溶解，再分別加入0.1ml供試品和供試品陽(yáng)性各濃度稀釋液，混勻后，于37±1℃無(wú)振動(dòng)保溫60± 2分鐘，同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)濃度平行做2管。

結(jié)果表明，依替巴肽注射液（100ml：75mg）在18.75mg/ml以下稀釋度時(shí)，對(duì)以上二個(gè)廠家的鱟試劑均未產(chǎn)生干擾作用。故18.75mg/ml稀釋度為最小不干擾稀釋倍數(shù)。根據(jù)依替巴肽注射液（100ml：75mg）的試驗(yàn)結(jié)果，依替巴肽注射液（100ml：75mg）選取15mg/ml稀釋液作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的供試品溶液濃度。

1.2.3.2 供試品的干擾試驗(yàn)：

為進(jìn)一步確證供試品溶液對(duì)0.06EU/ml的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和供試品15mg/ml稀釋液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內(nèi)毒素溶液。

1.2.3.2.1 供試品15mg/ml稀釋液的制備： 取上述三個(gè)批號(hào)的供試品，分別用BET水稀釋成15mg/ml供試液。

1.2.3.2.2試驗(yàn)過(guò)程（鱟試劑：λ=0.06EU/ml）：——用BET水與15mg/ml供試液分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml、0.015EU/ml四個(gè)濃度，作為細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素供試品溶液。

——取上述二個(gè)廠家的鱟試劑各72支，每支分別用0.1mlBET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素供試品溶液各0.1ml，每一濃度平行做4管，輕輕混勻。同時(shí)分別用0.1ml鱟試驗(yàn)用水和供試品溶液做陰性對(duì)照，平行做兩管。垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開(kāi)始準(zhǔn)確記錄時(shí)間，在37±1℃無(wú)振動(dòng)保溫60± 2分鐘。

表1 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

Table 1 Preliminary Test of Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）

注1：“NPC”為供試品溶液 “PPC”為供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液 “NC”為陰性對(duì)照 “PC”為陽(yáng)性對(duì)照 “+”為凝固，“-”為未凝固。

1.2.3.2.3 試驗(yàn)結(jié)果

表2 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干擾試驗(yàn)

Table 2 Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml：75 mg）

注1：“+”為凝固，“-”為未凝固。

表2試驗(yàn)結(jié)果表明，15mg/ml供試品稀釋液的供試品的Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認(rèn)無(wú)干擾影響。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。[8]

2 結(jié)果

表3 依替巴肽注射液（100ml：75mg）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

Table 3 Bacterial Endotoxin Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）

注1：“+”為凝固，“-”為未凝固。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)條件下，取三個(gè)批號(hào)的供試品（100ml：75mg），用BET水分別按上述方法配制成15mg/ml供試品稀釋液（L<0.4EU/mg），然后用λ=0.06EU/ml的上述二個(gè)廠家的鱟試劑各16支實(shí)驗(yàn)Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認(rèn)無(wú)干擾影響。依替巴肽注射液經(jīng)過(guò)按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）對(duì)供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

參考文獻(xiàn)

[1] Balasubramaniam K， Viswanathan G N， Marshall S M， Zaman A G. Increased Atherothrombotic Burden in Patients with Diabetes Mellitus and Acute Coronary Syndrome： A Review of Antiplatelet Therapy[J]. Cardiol Res Pract，2012， 2012：909154.

[2] Ferreiro J L， Angiolillo D J. Diabetes and antiplatelet therapy in acute coronary syndrome[J]. Circulation， 2011， 123（7）：798-813.

[3] Davi G， Patrono C. Platelet activation and atherothrombosis[J]. N Engl J Med， 2007， 357（24）：2482-2494.

[4] Fuster V， Moreno P R， Fayad Z A， Corti R， Badimon J J. Atherothrombosis and high-risk plaque： part I： evolving concepts[J]. J Am CollCardiol， 2005， 46（6）： 937-954.

[5] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測(cè)方法驗(yàn)證的必要性[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4：）46

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì)編，中國(guó)藥典二部附錄，北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：6

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì)編，中國(guó)藥典二部附錄，北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：100

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì)編，中國(guó)藥典二部附錄，北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：101