作者簡介：沈棟林（1973、3-） 男 ，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病；李同歡，男，主治醫(yī)師，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；

通訊作者：束曉梅，女，教授，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

摘要：

目的：探討新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cells， NSCs）體外分離培養(yǎng)的條件和傳代的新方法。方法：從新生大鼠海馬中分離神經(jīng)干細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)技術(shù)，在表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）、堿性成纖維生長因子（ basic fibroblast growth factor， bFGF）和B27聯(lián)合作用下使其不斷增殖克隆，采用神經(jīng)小球分離試劑盒進(jìn)行傳代，利用免疫熒光染色的方法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：從新生大鼠海馬分離的細(xì)胞群可不斷增殖形成細(xì)胞克隆球，并能穩(wěn)定傳代，呈nestin陽性表達(dá)，且具有多向分化能力。采用神經(jīng)小球分離試劑盒傳代的細(xì)胞球生長快，數(shù)量多，體積大，折光性好。結(jié)論：利用無血清技術(shù)和特定生長因子，可以使來源于新生大鼠海馬的NSCs在體外擴(kuò)增，利用大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒可以有效地進(jìn)行傳代，穩(wěn)定高效地培養(yǎng)出NSCs。

關(guān)鍵詞：NSCs；分離培養(yǎng)；傳代

【中圖分類號】

R329.2+8 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1002-3763（2014）06-0024-01

目前越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，NSCs在治療難治性癲癇、顱腦外傷、腦腫瘤、阿爾茨海默病等方面，發(fā)揮了重要作用[1-2]。簡潔高效地獲得NSCs，將更好地為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。我們從新生大鼠海馬中分離NSCs，在體外進(jìn)行培養(yǎng)、傳代和分化，為進(jìn)一步利用NSCs進(jìn)行科學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑： 0～1 d的新生Wistar大鼠，由遵義醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、EGF、bFGF、 B27添加劑、胎牛血清購自Gibco公司。大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒購自StemCell Technologies公司。巢蛋白（Nestin）多克隆抗體、神經(jīng)元特異烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、SABC-CY3免疫熒光試劑盒購自Boste公司。

1.1.2 NSCs培養(yǎng)基： 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12中加入 2% B27 、20μg/L 的EGF 及10μg/L 的bFGF 組成。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分離及原代培養(yǎng)： 取0～1 d的新生Wistar大鼠，75%酒精消毒，無菌條件下迅速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬，將組織剪成小碎塊，反復(fù)吹打至組織變?yōu)槿槊訝?，通過200目的濾網(wǎng)，離心、棄去上清液，用NSCs培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度在5×105 /mL，接種于50 mL 培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每2～3天半量換液一次，培養(yǎng)5～7天后當(dāng)神經(jīng)球直徑達(dá)到100～200 μm時，進(jìn)行傳代。

1.2.2 NSCs的傳代： 當(dāng)原代NSCs培養(yǎng)至5～7天后神經(jīng)球直徑達(dá)到100～200 μm時，可進(jìn)行傳代。將細(xì)胞球和培養(yǎng)基移入無菌的15 mL離心管中，離心、棄上清。采用StemCell公司的大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒進(jìn)行傳代。將離心后的神經(jīng)球用試劑盒A溶液0.5 mL重懸，加入試劑盒B溶液0.125 mL作用8分鐘，于作用3分鐘和7分鐘時用吸管輕柔吹打細(xì)胞懸液各8次，8分鐘后加入試劑盒C溶液0.04 mL，輕柔吹打8次，加入0.35 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，使其最終體積為1 mL。離心、棄上清，NSCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照5×105 /mL密度接種在完全培養(yǎng)基中，于接種后1、2、3、5 d在100倍倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察4個視野，每種方法6個標(biāo)本，計(jì)數(shù)神經(jīng)球生長的個數(shù)。

1.2.3 NSCs免疫熒光鑒定： 取生長良好的第三代NSCs克隆球接種到6孔板中，待細(xì)胞球貼壁時吸出培養(yǎng)基，經(jīng)固定、透膜后，加入1：100一抗（兔抗Nestin多克隆抗體）及1：100二抗，最后滴加1：100 CY3，用抗熒光萃滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 NSCs分化培養(yǎng)及鑒定： 將生長良好的第三代NSCs接種到6孔板中，培養(yǎng)液中加入終濃度為10%的胎牛血清，在經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行爬片。至分化培養(yǎng)3天后，將爬片取出，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定，步驟同前，一抗分別1：200的兔抗NSE多克隆抗體及兔抗GFAP多克隆抗體。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所測數(shù)據(jù)采用X±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)； P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬NSCs的形態(tài)學(xué)觀察： 原代細(xì)胞接種后，即在相差顯微鏡下觀察為懸浮的圓形細(xì)胞，邊界清楚，折光性強(qiáng)，絕大部分成單個存在。接種24～48 h后，單細(xì)胞的比例顯著減少，大多數(shù)細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中并形成小的細(xì)胞團(tuán)，此為NSCs球。隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞球逐漸增大，至5～7天時生長成為數(shù)十乃至上百個細(xì)胞的集落，呈球形、桑葚狀，折光性好。

2.2 NSCs傳代后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察： 體外培養(yǎng)的NSCs經(jīng)大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒予以神經(jīng)球分離后，絕大多數(shù)神經(jīng)球分散成單細(xì)胞，背景清晰，細(xì)胞碎片較少。2～3天后重又形成新的細(xì)胞球，新細(xì)胞球生長快，數(shù)量多，體積大，折光性好。培養(yǎng)4～6天，細(xì)胞球直徑在100～200 μm，即可再次傳代。

2.3 NSCs鑒定、分化：原代和第三代NSCs克隆球Nestin細(xì)胞免疫熒光染色呈陽性。在NSCs培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清數(shù)小時后，NSCs球即開始貼壁并分化，從球體向外生長出有很多細(xì)長突起的細(xì)胞。此后分化的細(xì)胞逐漸增多，且從細(xì)胞球中心向外遷移出來，呈放射狀。細(xì)胞免疫熒光染色顯示，在胎牛血清誘導(dǎo)分化下，NSCs可分化成表達(dá)NSE的神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞。從細(xì)胞形態(tài)、生長特點(diǎn)和免疫熒光染色結(jié)果都說明培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。

3 討論

NSCs是一種原始的未分化細(xì)胞，它有和成熟神經(jīng)細(xì)胞相同的基因，且具有自我更新、增殖和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多向分化的潛能。本實(shí)驗(yàn)借鑒Vescovi等[3]的方法，以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輔以B27添加劑，同時加入bFGF及EGF構(gòu)成完全培養(yǎng)基。在促進(jìn)NSCs分裂方面，bFGF、EGF是最常用的兩種絲裂原。有文獻(xiàn)報(bào)道EGF可以促進(jìn)NSCs進(jìn)行對稱性分裂，而bFGF可促進(jìn)NSCs進(jìn)行非對稱性分裂 [4]，bFGF與EGF同時應(yīng)用，bFGF可以顯著加強(qiáng)EGF的作用。本實(shí)驗(yàn)將bFGF與EGF聯(lián)合應(yīng)用，成功快速地培養(yǎng)出NSCs，并進(jìn)行了有效地增殖和分化。Nestin屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，僅在胚胎早期神經(jīng)上皮表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)前體細(xì)胞向終末方向分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞時，nestin即停止表達(dá)，因此被廣泛用于NSCs的鑒定。而成熟神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞則分別表達(dá)其特異性標(biāo)志物NSE和GFAP。本實(shí)驗(yàn)對所培養(yǎng)的NSCs進(jìn)行了nestin細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示培養(yǎng)獲得的細(xì)胞球nestin呈陽性。同時在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，這些nestin陽性細(xì)胞球逐漸向外長出突起，分化為各種神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色，這些細(xì)胞包含表達(dá)NSE的神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞，表明培養(yǎng)的NSCs具有多向分化能力。

NSCs的體外培養(yǎng)方式有神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)和單層貼壁培養(yǎng)兩種，目前大多采用的仍是懸浮培養(yǎng)的方法，形成的細(xì)胞克隆呈球狀生長，原代培養(yǎng)3-7天細(xì)胞球直徑可達(dá)100 μm以上，由數(shù)十乃至數(shù)百個細(xì)胞組成。位于球體中央的細(xì)胞由于缺乏營養(yǎng)，逐漸死亡，并影響其周圍的NSCs生長[5]，因此必須及時進(jìn)行細(xì)胞球的分離，使之成為單細(xì)胞或小的細(xì)胞球。NSCs球的分離常用方法有兩種，即酶消化法和機(jī)械吹打法。酶消化法主要是通過胰蛋白酶水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)使細(xì)胞分離，但是細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)也可被消化從而引起細(xì)胞的損傷和死亡。機(jī)械吹打雖然避免了細(xì)胞膜被消化，但是反復(fù)的吹打可以造成細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，亦可導(dǎo)致細(xì)胞活性下降及死亡，同時較大的神經(jīng)球不易分離，也進(jìn)一步減少了單細(xì)胞形成的數(shù)量。所以NSCs能否有效地傳代，最大程度地保持細(xì)胞存活，是體外大量增殖NSCs的關(guān)鍵。大鼠神經(jīng)小球分離試劑盒通過化學(xué)解離的方法來分散神經(jīng)球，減輕了對細(xì)胞的損傷[6]。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過神經(jīng)小球分離試劑盒分散的細(xì)胞，其細(xì)胞存活率及細(xì)胞擴(kuò)增的數(shù)量均明顯高于機(jī)械吹打法分離的細(xì)胞。同時，神經(jīng)小球分離試劑盒具有規(guī)范化的操作步驟，簡單易行，盡可能地減小了由不同操作者帶來的差異，更有利于實(shí)驗(yàn)研究。因此，通過這種化學(xué)解離的方法可以快速高效地對NSCs傳代擴(kuò)增，為實(shí)驗(yàn)研究和臨床移植應(yīng)用提供了便利。然而體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，與體外培養(yǎng)有著一定的差距，它還受到周圍特殊的環(huán)境，即小生境的影響。因此利用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植和基因治療還需要進(jìn)一步的研究和探索。

參考文獻(xiàn)

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