摘要：植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是指借助顯微操作技術(shù)對(duì)具有高遺傳病風(fēng)險(xiǎn)夫婦，從其體外受精培養(yǎng)得到的胚胎中取出個(gè)別卵裂球細(xì)胞或極體或幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢查，通過(guò)分析選擇正常的胚胎移植，可以防止遺傳學(xué)異常妊娠的發(fā)生，將產(chǎn)前診斷提前到胚胎植入子宮內(nèi)膜之前。避免了反復(fù)流產(chǎn)、引產(chǎn)對(duì)孕婦及其家庭造成的傷害。但由于可用于PGD分析的材料為胚胎中取出的個(gè)別卵裂球細(xì)胞或極體或幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞，這些材料十分有限，所以在進(jìn)行PGD之前，需對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（whole genome ampliflication，WGA），全基因組擴(kuò)增一組在基因組DNA數(shù)量極有限情況下對(duì)全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒(méi)有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量，對(duì)進(jìn)行疾病診斷的組織或單個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行大量擴(kuò)增，使得后續(xù)分析的模板量增加，從而完成多位點(diǎn)、多基因的檢測(cè)研究。該技術(shù)能很好的解決PGD的標(biāo)本少和準(zhǔn)確性要求高等要求。本文介紹了WGA方法中PEP、DOP-PCR、MDA應(yīng)用于PGD的情況，分析了MDA方法的優(yōu)勢(shì)與不足。

關(guān)鍵詞：植入前遺傳學(xué)診斷；全基因組擴(kuò)增；多重置換擴(kuò)增

【中圖分類(lèi)號(hào)】R596.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1002-3763（2014）02-0001-02

作者簡(jiǎn)介：楊超（1988-），男，碩士研究生，研究方向：胚胎植入前遺傳學(xué)診斷

1 引言

伴隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，特別是體外受精-胚胎移植（IVF-ET）及單精子胞漿內(nèi)顯微注射（ICSI）的廣泛應(yīng)用，使得越來(lái)越多的不育患者實(shí)現(xiàn)了生育下一代的愿望，但隨之而來(lái)的遺傳病的患病風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加[1]，而胚胎植入前遺傳學(xué)診斷卻能有效地降低后代患遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)，故胚胎植入前遺傳學(xué)診斷將成為臨床檢驗(yàn)的重要手段。

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）是指借助顯微操作技術(shù)對(duì)具有高遺傳病風(fēng)險(xiǎn)夫婦，從其體外受精培養(yǎng)得到的胚胎中取出個(gè)別卵裂球細(xì)胞或極體或幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢查，通過(guò)分析選擇正常的胚胎移植，可以防止遺傳學(xué)異常妊娠的發(fā)生，將產(chǎn)前診斷提前到胚胎植入子宮內(nèi)膜之前。該技術(shù)包括體外受精胚胎移植（in vitro fertilizatio-and embryo transfer， IVF-ET）的臨床手段，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybrid dization， FISH）等檢測(cè)技術(shù)。

全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）是一組在基因組DNA數(shù)量極有限情況下對(duì)全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒(méi)有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量，對(duì)進(jìn)行疾病診斷的組織或單個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行大量擴(kuò)增，使得后續(xù)分析的模板量增加，從而完成多位點(diǎn)、多基因的檢測(cè)研究。該技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、疾病基因研究、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域。近年在胚胎植入前遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用也受到關(guān)注[2]。

2 全基因組擴(kuò)增（WGA）的方法

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展極大得推進(jìn)了微量DNA樣本的分析，但由于許多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或幾次PCR反應(yīng)。為了能從極少量細(xì)胞中最大限度的獲取信息，需要用全基因組擴(kuò)增技術(shù)（WGA）將原始DNA序列放大。

WGA技術(shù)如今已經(jīng)發(fā)展形成以PCR為基礎(chǔ)的PEP和DOP-PCR技術(shù)和不以PCR為基礎(chǔ)使用隨機(jī)引物恒溫?cái)U(kuò)增的多重置換擴(kuò)增技術(shù)（multiple displacement amplification，MDA）。

2.1 PEP和DOP-PCR技術(shù)

引物延伸預(yù)擴(kuò)增（Primer extension preamplification，PEP）用到的是PCR技術(shù)、Taq酶和由15個(gè)堿基的隨機(jī)寡聚核苷酸組合出415種不同序列的引物，其變性后在37℃條件下低溫退火，然后緩慢升至55℃延伸，隨機(jī)擴(kuò)增基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋接近基因組96%區(qū)域，同時(shí)放大1000倍[3]，PEP后續(xù)采用巢式PCR或以其終產(chǎn)物為模板，使用特異的引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，從而到達(dá)檢測(cè)的目的。普通PEP的總反應(yīng)時(shí)間需經(jīng)歷14h，其較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)周期阻礙了其在臨床PGD檢測(cè)中的應(yīng)用。在改善普通PEP的反應(yīng)體系以及熱循環(huán)條件后，其反應(yīng)時(shí)間縮短至5.5h[4]，雖然反應(yīng)時(shí)間縮短，但改良后的PEP仍然保持著原有擴(kuò)增效率，甚至提高了擴(kuò)增的特異性，其命名為改良的引物延伸反應(yīng)預(yù)擴(kuò)增（improve-PEP，I-PEP）。2003年Jiao等[5]應(yīng)用PEP結(jié)合巢式PCR技術(shù)及反向點(diǎn)雜交技術(shù)（RDB）的方案，對(duì)β-地中海貧血攜帶者行PGD，成功出生了健康的小孩。然而，普通PEP擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度達(dá)不到1500bp，較低的擴(kuò)增率、產(chǎn)生片段的過(guò)短成為PEP技術(shù)在PGD中廣泛應(yīng)用的最主要障礙。

另一種WGA方法是簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR），其操作相對(duì)PEP更簡(jiǎn)單，采用部分簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，這些引物會(huì)結(jié)合于整個(gè)基因組序列，在低退火溫度運(yùn)行幾個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，讓引物充分與基因組DNA結(jié)合，隨后提高退火溫度進(jìn)行更特異的擴(kuò)增。DOP-PCR能將DNA模板能從開(kāi)始時(shí)的15pg增至400ng，且能按比例均勻擴(kuò)增整個(gè)基因組DNA[6] 。但和PEP一樣，DOP-PCR只能擴(kuò)增出相對(duì)較短的產(chǎn)物，2002年Kittle等[7]將其改良，其使用核酸外切酶矯正DNA聚合酶的活性，增加DOP-PCR退火和延伸的時(shí)間，其結(jié)果是擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度由原來(lái)0.5kb增至10kb，更好地覆蓋了微隨體區(qū)域和單拷貝序列。

2.2 多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)

MDA技術(shù)是目前最受關(guān)注的WGA技術(shù)，不同于以PCR為基礎(chǔ)的PEP和DOP-PCR技術(shù)存在擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)短、偏性擴(kuò)增明顯等缺點(diǎn)，該技術(shù)是不需以PCR為基礎(chǔ)的具有更高擴(kuò)增效率、更廣覆蓋域及更高保真度的新的擴(kuò)增技術(shù)。

MDA是一種基于鏈置換和環(huán)狀滾動(dòng)擴(kuò)增的全基因組擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用一種φ29 DNA聚合酶催化六聚體隨機(jī)引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為在30℃下恒溫。擴(kuò)增時(shí)，六聚體隨機(jī)引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA退火，在φ29 DNA聚合酶的作用下同時(shí)啟動(dòng)復(fù)制。引物沿著模板鏈延長(zhǎng)，同時(shí)取代模板的互補(bǔ)鏈。被置換的互補(bǔ)鏈又作為新的模板完成一次擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的循環(huán)，最終經(jīng)過(guò)65℃滅活可獲得大量的DNA。該技術(shù)適用于各種樣本，低DNA含量的樣本，尤其是在臨床應(yīng)用中常出現(xiàn)的單細(xì)胞取材，如單個(gè)淋巴細(xì)胞、單個(gè)精子、單個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞或卵裂球等。也可直接從新鮮或干燥的全血、白膜層和培養(yǎng)的細(xì)胞等進(jìn)行擴(kuò)增，也可是石蠟包埋的樣品，但效果較差[8]。

在臨床應(yīng)用中，MDA表現(xiàn)出高擴(kuò)增效率和精確性，相較于以PCR基礎(chǔ)的WGA方法，MDA表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。2009年Ren等[9]通過(guò)MDA技術(shù)擴(kuò)增單細(xì)胞基因組DNA完成兩家DMD臨床PGD實(shí)驗(yàn)，每個(gè)家系均分析了一個(gè)DMD基因的突變位點(diǎn)和6個(gè)STR連鎖標(biāo)記，最后各出生一個(gè)健康的女孩。2010年Eduardo等[10]用MDA技術(shù)結(jié)合PCR-連鎖分析完成了1家PKHD1家系的臨床PCR實(shí)驗(yàn)，他們共分析了20個(gè)PKHD1基因及其側(cè)翼序列中的STR位點(diǎn)，最終出生了一個(gè)健康孩子。

2.2.1 MDA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

首先是其持續(xù)合成能力，MDA方法比以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增方法擴(kuò)增效率更高，可將微量模版擴(kuò)大數(shù)千倍以上。φ29DNA聚合酶的合成力極強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)物片段平均長(zhǎng)度可大于10kb。而在PCR反應(yīng)中，反復(fù)的變性和退火約40個(gè)循環(huán)左右，DNA擴(kuò)增即進(jìn)入平臺(tái)期，MDA因?yàn)槠浞磻?yīng)全程恒溫，其酶活性能持續(xù)長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)，從而可產(chǎn)生足夠量的DNA來(lái)完成PGD及STR位點(diǎn)的檢測(cè)[11]。第二，MDA方法的脫扣率較以往PCR基礎(chǔ)的擴(kuò)增方法進(jìn)行WGA低。在微衛(wèi)星基因座上滑脫是的WGA一個(gè)大問(wèn)題，φ29DNA聚合酶從理論上講能減少微衛(wèi)星在基因座上的滑脫率。第三，MDA方法的高保真性，φ29DNA聚合酶具有外切酶活性，可均勻擴(kuò)增DNA而不出現(xiàn)擴(kuò)增偏差，其錯(cuò)配率僅為1：106 ～1：107，而TaqDNA酶的錯(cuò)配率3：104[13]，相較之下φ29DNA聚合酶可保證擴(kuò)增效果。第四，無(wú)論MDA擴(kuò)增起始濃度差異多大，其終濃度穩(wěn)定，基因組DNA經(jīng)過(guò)30℃反應(yīng)6～8h，擴(kuò)增在達(dá)到高峰后維持于一個(gè)穩(wěn)定水平使所有反應(yīng)的DNA產(chǎn)量保持在20～30μg左右。

2.2.2 MDA技術(shù)的不足

MDA目前仍然存在一些不足，2005年Sun等[15]綜合比較了I-PEP、MDA方法的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)果提示MDA方法擴(kuò)增效率大于I-PEP方法，但特異性較I-PEP差，片段大小差別大，在一些微衛(wèi)星位點(diǎn)分型時(shí)，可能會(huì)發(fā)生脫扣。MDA反應(yīng)靈敏度極高，起始模板量少故極易污染，若用單個(gè)細(xì)胞做PGD，污染問(wèn)題將會(huì)更加突出。污染物與待檢測(cè)模板競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增，經(jīng)PCR放大后極大影響了診斷的準(zhǔn)確性。

3 單細(xì)胞WGA擴(kuò)增后續(xù)分析技術(shù)

3.1 單體型分析

胚胎植入前單體型分析（Preimplantation genetic haplotyping，PGH）是PGD中一個(gè)新的方法，是利用短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）在DNA復(fù)制過(guò)程中會(huì)發(fā)生一個(gè)或幾個(gè)單位的重復(fù)或缺失的特點(diǎn)，在人群重復(fù)次數(shù)會(huì)出現(xiàn)特異且符合孟德?tīng)栠z傳定律的原理，進(jìn)行家系分析確定攜帶突變的染色體的簡(jiǎn)易診斷的手段，其最大的優(yōu)勢(shì)是能發(fā)現(xiàn)任何單基因病甚至已確定的缺失。但是需要在進(jìn)行PGH分析之前仔細(xì)研究至少有一個(gè)患者的家系中并找到一些能用于攜帶者的連鎖標(biāo)記。2006年Renwick等[16]成功用MDA產(chǎn)物通過(guò)PGH方法應(yīng)用于囊性纖維變性和DMD并使受孕。

現(xiàn)在，PGH應(yīng)用了將熒光標(biāo)記在PCR擴(kuò)增引物上的熒光PCR，并通過(guò)熒光電泳進(jìn)行單體型分析，大大縮短了PGH的時(shí)間，作為一種代替診斷的方法，PGH增加了PGD診斷的范圍和可用性。

3.2 SNP分型

單核苷酸多態(tài)（Single nucleotide polymorphism，SNPs）是占人類(lèi)基因突變的很大比例并會(huì)增加人類(lèi)患病風(fēng)險(xiǎn)的單核苷酸改變。但SNP關(guān)聯(lián)分析需要足量的基因組DNA，WGA使之成為可能。WGA之后的SNP分析不僅提供了一種可靠的評(píng)估DNA產(chǎn)品的方法，同時(shí)在探究染色體畸變實(shí)驗(yàn)中也呈現(xiàn)出高精確性和可重復(fù)性，2009年ling等[17]通過(guò)MDA結(jié)合SNP分析的方案成功發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生了單體和三體的染色體數(shù)目畸變。WGA結(jié)合SNP方案尚處在發(fā)展的初級(jí)階段，以后的發(fā)展不可估量。

4 總結(jié)

PGD中可獲得的細(xì)胞數(shù)量、DNA都極其有限。進(jìn)行PGD分析需要大量反映原始遺傳信息的DNA，WGA用于PGD基因分析令人鼓舞，其恰好解決了這種單細(xì)胞擴(kuò)增的問(wèn)題且臨床檢測(cè)技術(shù)使用正不斷發(fā)展。尤其是MDA技術(shù)打開(kāi)了需要大量DNA的多重檢測(cè)之門(mén)，使后續(xù)各種DNA分析技術(shù)得以開(kāi)展，現(xiàn)在也成最主要的WGA技術(shù)。WGA后續(xù)的操作如PGH、SNPs等將PGD適用的范圍擴(kuò)大。盡管不同的WGA方法都有其優(yōu)勢(shì)與不足，未來(lái)的發(fā)展將不斷改善，比如如何減少甚至避免小量標(biāo)本的擴(kuò)增假象、如何減少擴(kuò)增中出現(xiàn)的偏向擴(kuò)增和等位基因脫扣、如何避免污染等問(wèn)題。WGA為PGD的效率、可操作性等方面帶來(lái)了光明前景，可以想象在不遠(yuǎn)的將來(lái)WGA極有希望成為PGD重要而不可缺少的組成部分。

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