鄭軍 鄔麗蘋(píng) 王天霆

[摘要]目的：探討MCL-1在口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral squamous cells carcinoma，OSCC）組織中的表達(dá)情況及意義。方法：采用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)OSCC和口腔正常黏膜組織中MCL-1蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果：MCL-1蛋白在OSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為61.9%（52/84），在口腔正常黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為15.0%（3/20），兩組有顯著性差異（P<0.001）；MCL-1 mRNA在OSCC腫瘤組織中的含量高于癌旁正常組織（P<0.05）。結(jié)論：MCL-1的高表達(dá)在OSCC的發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。

[關(guān)鍵詞]口腔鱗狀細(xì)胞癌；MCL-1；免疫組織化學(xué)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)]R783 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）15-1257-03

The expression of MCL-1 and its significance in oral squamous cells carcinoma

ZHENG Jun1，WU Li-ping1，WANG Tian-ting2

（1.Department of Stomatology，The First Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University Shihezi 832000， Xinjiang，China；2.Department of Stomatology， Hami Hongxing Hospital）

Abstract： Objective To explore the expression of MCL-1 and its significance in oral squamous cell carcinoma（OSCC）. Methods The expression of MCL-1 protein was detected using immunohistochemistry， and the MCL-1 mRNA was assayed by real-time fluorescent quantitative PCR. Results 52 of 84 samples（61.9%）in OSCC tissues were found to over-express MCL-1 protein，while 3 of 20 samples（15.0%）in oral normal mucosa tissues were found to over-express MCL-1 protein. Statistical differences（P<0.001）existed between these two groups. The expression of MCL-1 mRNA in OSCC was higher than in OSCC adjacent normal tissues （P<0.05）. Conclusion The high expression of MCL-1 in OSCC has played an important role in the development of OSCC.

Key words：OSCC；MCL-1； Immunohistochenistry；real-time fluorescent quantitative PCR

髓細(xì)胞白血病-1（myeloid cell lekemia-1，MCL-1）基因是抗凋亡基因BCL-2家族成員，其在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中是一個(gè)必要的抗凋亡因子，調(diào)節(jié)其表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)調(diào)節(jié)紊亂都會(huì)引起MCL-1的過(guò)度表達(dá)，從而導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)人類一些疾病的發(fā)生。MCL-1過(guò)表達(dá)可引起在人類的造血系統(tǒng)的腫瘤以及多種實(shí)體瘤[1]，MCL-1蛋白表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，提示MCL-1是人類多種腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[2]。MCL-1在多種癌組織中呈高表達(dá)，而在癌旁組織中呈低表達(dá)狀態(tài)[3]，在OSCC中，MCL-1的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)MCL-1在OSCC和口腔正常黏膜組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討MCL-1基因在OSCC發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本：收集經(jīng)我院口腔頜面外科于1993～2011年手術(shù)切除的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者石蠟包埋標(biāo)本84例，其中舌癌38例，頰癌22例，牙齦癌16例，口底癌8例。所選擇的標(biāo)本為術(shù)前均未行放化療、無(wú)其他合并腫瘤，術(shù)后經(jīng)病理診斷明確的病例。男性患者57例，女性患者27例；漢族77例，少數(shù)民族7例；高分化44例，中分化33例，低分化7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例；臨床分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期26例，Ⅲ期14例，Ⅳ14例。同時(shí)收集經(jīng)HE染色確診的口腔正常黏膜組織標(biāo)本20例，所有標(biāo)本常規(guī)福爾馬林液固定后石蠟包埋、切片備用。另收集了12例OSCC患者的腫瘤及相應(yīng)的瘤旁5cm以外組織（病理均確認(rèn)為正常組織），臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，均切成1.0cm×0.8cm×0.5cm的小塊，分別包于錫箔紙中，標(biāo)記好并凍存于液氮中備用。

1.1.2 試劑：Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Imprim-ⅡTM（A3800）購(gòu)自Promega公司，Real time SYBR GreenⅠPCR Master Mix購(gòu)自TOYOBO公司，所需引物由上海生工生物有限公司合成，目的基因MCL-1的引物序列：5′-AGACGATGTGAAATCG- 3′和 5′-TAACTAGCCAGTCC CG-3′。內(nèi)參基因GAPDH的引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和 5′-ATGGTGGTGAA GACGCCAGT- 3′。多克隆兔抗人MCL-1（S-19）抗體（SC-819，稀釋度為1：100）購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司，抗體稀釋液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，Envision 免疫組化試劑、DAB顯色劑購(gòu)自丹麥DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化和結(jié)果判定：采用免疫組化Envision法染色，將制好的組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后行免疫組化染色?？乖捎梦⒉ㄐ迯?fù)，余步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察。分別用肝癌MCL-1陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，用口腔正常黏膜組織標(biāo)本作陰性對(duì)照，用PBS代替一抗作空白對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：MCL-1陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿著色，呈棕黃色顆粒，隨機(jī)選取10 個(gè)高倍視野，結(jié)合著色范圍及強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。著色范圍以陽(yáng)性細(xì)胞百分率判定：<5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。著色強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞核著色深淺判定：無(wú)著色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。上述兩項(xiàng)相加為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性（-）：0 分；弱陽(yáng)性（+）：2～3 分；中度陽(yáng)性（++）：4～5 分；強(qiáng)陽(yáng)性（+++ ）：6～7 分。

1.2.2 總RNA提取與單鏈cDNA合成：從液氮中取出組織塊，迅速碾碎后采用Trizol抽提法提取總RNA。抽提出的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和0D280，以確定其濃度和純度，根據(jù)1 OD260= 40μg/ml計(jì)算核酸濃度。反應(yīng)體系：總RNA 1μg，0.5 g/μl Random primer 1μl，0.5 g/μl Oligo（dT）1μl ，DEPC水補(bǔ)至5μl后75℃水浴5min，冰上5min，短暫離心，加入以下試劑，10mM dNTP Mix 1μl，5×Reaction Buffer 4μl，Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5l，Reverse Transcriptase 1μl，25mM MgCl2 3.5μl，Nuclease- free H2O補(bǔ)至20μl后25℃，5min；42℃，60min；72℃，15min；煮沸5min；立即置冰上5min，-20℃放置待PCR 反應(yīng)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR：選用Sybr Green Ⅰ為熒光指示劑，應(yīng)用Cepheid公司smart Cycler

儀對(duì)各種mRNA起始拷貝進(jìn)行分析， 每1份cDNA 標(biāo)本分兩管進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 一管擴(kuò)增目的基因MCL-1， 另一管擴(kuò)增內(nèi)參基因GAPDH。反應(yīng)體系含cDNA 1μl，5uM Forward Primer 1μl，5uM Reverse Primer 1μl，2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix

2 結(jié)果

2.1 MCL-1蛋白在OSCC和口腔正常黏膜組織中的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示，MCL-1蛋白陽(yáng)性著色定位于胞漿，呈淡黃、棕黃或棕褐色。在OSCC組織中，MCL-1蛋白彌漫分布于胞漿中，染色強(qiáng)度為中等～強(qiáng)著色（如圖1A），陽(yáng)性表達(dá)率為61.9%（52/84），呈高表達(dá)。在口腔正常黏膜組織中，MCL-1蛋白表達(dá)水平較低，弱著色或不著色（如圖1B），陽(yáng)性表達(dá)率為15.0%（3/20），呈低表達(dá)。MCL-1在OSCC組織中的表達(dá)明顯高于口腔正常黏膜組織（χ2=14.263，P<0.001）。

2.2MCL-1 mRNA含量在OSCC患者腫瘤和癌旁正常組織中的差異：根據(jù)耙基因MCL-1和內(nèi)參基因GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線用公式Y(jié)=101/△CT，計(jì)算GAPDH和MCL-1的Y值近似相同約為2，表示兩者CT值減少1個(gè)循環(huán)對(duì)應(yīng)的模板DNA的增加倍數(shù)為2倍。根據(jù)上述結(jié)果可以應(yīng)用簡(jiǎn)化公式2-△△C（t）來(lái)計(jì)算。按上述公式計(jì)算結(jié)果為：12例OSCC腫瘤組織中MCL-1基因的mRNA表達(dá)的最低值為7.80×10-2，最高值為9.77×10-1（4.02±3.35×10-1）；而12例OSCC癌旁正常組織中的mRNA表達(dá)的最低值為1.26×10-2，最高值為1.82×10-1（7.42±6.25×10-2）。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，OSCC腫瘤組織中MCL-1 mRNA表達(dá)高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.162， P=0.020）。

3 討論

MCL-1基因是B細(xì)胞淋巴瘤基因-2家族中的一員，定位于人染色體1q21， 編碼蛋白分子量為42KD，含有350個(gè)氨基酸。其在許多正常組織中廣泛表達(dá)[4]，主要在上皮組織、淋巴組織的生發(fā)中心細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等人類正常組織中表達(dá)，并已有研究表明在胃癌[5]、肝癌[6]白血病[7]、肺癌[8]、胰腺癌等[9]腫瘤中高表達(dá)。MCL-1的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)[10]，在呈指數(shù)冪生長(zhǎng)的細(xì)胞中，MCL-1 主要位于線粒體；在靜止期細(xì)胞中，MCL-1主要位于細(xì)胞核。本研究發(fā)現(xiàn)OSCC組織MCL-1主要以胞漿表達(dá)為主，表明OSCC細(xì)胞處于快速增殖期，符合OSCC的腫瘤生物學(xué)特性。MCL-1 表達(dá)上調(diào)提示了腫瘤的發(fā)生，超過(guò)85%的轉(zhuǎn)MCL-1 基因小鼠在兩年內(nèi)發(fā)生了B 細(xì)胞淋巴瘤[11]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MCL-1在84例OSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率61.9%，正?？谇火つそM織中陽(yáng)性表達(dá)率15.0%，MCL-1 蛋白在OSCC中的表達(dá)高于正?？谇火つそM織（P<0.001），并且MCL-1 mRNA在OSCC腫瘤組織中的含量也高于癌旁正常組織（P<0.05）。這表明MCL-1高表達(dá)與OSCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為OSCC早期預(yù)警的重要指征。

總之，在正常組織以及腫瘤組織中MCL-1作為一個(gè)重要的存活因子，在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受多種機(jī)制的調(diào)節(jié)。人們對(duì)MCL-1的功能和調(diào)節(jié)的研究取得了重要的突破。隨著對(duì)MCL-1的進(jìn)一步研究和新技術(shù)的應(yīng)用，MCL-1有望為惡性腫瘤的診斷和基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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[收稿日期]2014-05-20 [修回日期]2014-06-15

編輯/何志斌