查玉兵等

摘要[目的]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LCMS/MS），在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下建立了四大南藥中黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）含量的測定方法。[方法]試樣中的黃曲霉毒素經(jīng)甲醇/水（70/30）提取，黃曲霉毒素免疫親和柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標法定量。[結(jié)果]該方法的檢出限（LOD）為0.2～0.5 μg/kg，線性范圍為0～50 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999；在2～50 μg/kg的添加水平上，4種霉菌毒素平均回收率為78.6%～92.1%，相對標準偏差RSD為0.8%～8.4%。[結(jié)論]該方法前處理簡單、快速，靈敏度、準確度和精密度高。

關(guān)鍵詞高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；黃曲霉毒素；四大南藥；含量

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12901-03

Abstract[Objective] The research aimed to develop the determination method of aflatoxin （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）content in four south medicines in the multiple reaction monitoring （MRM） mode by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （LCMS/MS）. [Method]The drugs were extracted with methanol/water（70/30，V/V），and cleaned up by using beacon aflatoxin column，dissolved in methanol and analysised by LCMS/MS.[Result]The limits of detection（LOD） were 0.2-0.5 μg/kg.The calibration curves were linear between 0 to 50 μg/L，and the correlation coefficient was more than 0.999.The average recoveries ranged from 78.6%-92.1% and RSD was 0.8%-8.4% by addition of 2-50 μg/kg avermectin standards to four south medicines as matrixes. [Conclusion] The proposed method was fast， simple， sensitive and accurate.

Key wordsUPLCMS/MS；Aflatoxin；Four south medicines；Contaminants

檳榔、益智、砂仁、巴戟天為海南盛產(chǎn)的我國四大南藥，檳榔用于驅(qū)蟲清積、引氣利尿，益智能溫脾暖胃、固本澀精，砂仁是引氣和中、開胃消食、止痛安胎之良藥，巴戟天則能補氣益精、強筋壯骨、祛風(fēng)除濕。目前，四大南藥在臨床上應(yīng)用十分廣泛[1]。然而，藥材在生產(chǎn)、加工、貯藏、運輸?shù)倪^程中，由于條件和技術(shù)簡陋，很容易發(fā)生霉變而產(chǎn)生黃曲霉毒素（AFT）。

黃曲霉毒素發(fā)現(xiàn)于1960 年，毒性為氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍。AFT可引起肝臟的急慢性損害，同時還對腎臟等其他多種組織器官造成嚴重損害，且具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致” 作用[2]。韓國食品醫(yī)藥品安全廳（KFDA）發(fā)布了有關(guān)中藥材中黃曲霉毒素B1限量標準和試驗方法的公告，要求甘草、決明子、桃仁等9味中藥材黃曲霉毒素B1低于10 μg/kg[3] 。泰國允許黃曲霉毒素B1的限量20 μg/kg[4]，我國原外經(jīng)貿(mào)部WM2-2001《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》[5]中AFT 限量標準為小于5 μg/kg。《中國藥典》2010版一部僅對桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規(guī)定AFB1最高限量5 μg/kg，AF（B1+B2+G1+G2）最高限量為10 μg/kg。目前，黃曲霉毒素的測定方法主要有薄層色譜法（TLC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7]、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）[8]以及生物傳感器法等。但由于無法對樣品進行準確的定性和定量分析，且容易出現(xiàn)假陽性等問題，不能作為最終的確證方法。筆者采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定四大南藥中黃曲霉毒素含量，不僅簡化了前處理步驟，且大大提高了方法的檢出限。

1材料與方法

1.1儀器

Waters ACQUITY UPLCTMTQD MS/MS系統(tǒng)（美國waters）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R205（瑞士BUCHI公司）；超聲波清洗器（德國ELMA公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；MilliQ純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2試劑乙腈（色譜純）；甲醇（分析純）；甲酸（色譜純）；乙酸（色譜純）；乙酸銨（色譜純）；乙酸乙酯（分析純）；水為二次蒸餾水；黃曲霉毒素免疫親和柱（柱容量約300 ng 黃曲霉毒素，3 ml）；黃曲霉毒素標準品。

1.3標準溶液的配置稱取適量黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準品，分別用甲醇溶解于25 ml容量瓶中，配成100 μg/ml的標準儲備液，使用時根據(jù)需要以流動相稀釋成標準工作液。

分別吸取適量儲備溶液（標準溶液）于同一容量瓶中，用甲醇配制成1.0 μg/ml的混合標準中間液，于4 ℃保存。吸取適量上述混合標準中間液，用乙腈配制成不同濃度的標準系列工作液。

1.4黃曲霉毒素的提取

稱取5.0 g樣品于50 ml 離心管中，加入1 g氯化鈉及50 ml 甲醇-水（70∶30，V/V）高速勻漿1 min，用玻璃纖維濾紙過濾，取20 ml上濾液加入10 ml水，搖勻，備用。

1.5提取物的凈化

精密吸取濾液15 ml，通過免疫親合柱（1～2滴/秒），棄去流出液，用10 ml水分2次洗脫，棄去洗脫液，抽干，再用2.0 ml甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。過0.2 μm濾膜，供LCMS/MS測定。

1.6色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH，50×2.1 mm，1.7 μm；流動相為乙腈（A）/ 0.1甲酸水溶液（V/V）。梯度洗脫程序為0～1 min，90%A；1.0～2.2 min，90%～50%A；2.2～3.0 min，50%～90%A；3～4 min，90%A保持1 min。流速為0.2 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μl。離子源為ESI，正離子模式；毛細管電壓4.0 kV；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量800 L/ hr；錐孔反吹氣流量50 L/hr；錐孔電壓40 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。用于定性、定量的離子對和相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇

在試驗過程中，提溶劑的選擇直接影響方法的準確度。黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，該試驗分別選用甲醇、乙腈、水、甲醇/水和乙腈/水作為萃取溶劑。試驗證明，用甲醇/水體系比其他溶劑的提取回收率高，比較了甲醇/水在70/30、80/20和90/10時的添加回收率，當(dāng)甲醇/水為70/30時，4種黃曲霉毒素的回收率最高。所以選取了70/30甲醇/水作為提取溶劑。

2.2液相色譜及質(zhì)譜條件的選擇

用乙腈作為有機相，在流動相中分別加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mM乙酸銨，結(jié)果表明乙腈和0.1%甲酸水溶液作梯度洗脫時，能夠獲得最強的離子豐度，所以最終確定乙腈和0.1%甲酸為流動相。試驗中嘗試了分別采用正、負2種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效率明顯高于負離子模式。通過全離子掃描（ Full scan）確定4種黃曲霉毒素的選擇離子，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液的總離子流圖如圖1所示。

2.4實際樣品的檢測

從市場采購了檳榔、益智、砂仁、巴戟天4種南藥，每種采購3 批，然后按照上述方法測定樣品中黃曲霉毒素的含量。結(jié)果表明，益智中的黃曲霉毒素含量最高，且所有益智樣品中4種黃曲霉毒素的陽性率均為100%，其中AFB1含量最高的為0.81 μg/kg，遠低于《中國藥典》2010版一部僅對桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規(guī)定AFB1 最高限量5 μg/kg，而4種黃曲霉毒素總量最高的為10.3 μg/kg，稍高于《中國藥典》2010版一部僅對桃仁、胖大海、陳皮等幾味藥材規(guī)定AF（B1+B2+G1+G2）最高限量10 μg/kg。檳榔樣品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的陽性率分別為80%、60%、20%和20%，其中AFB1和AFB2含量最高的分別為1.83和1.44 μg/kg，4種黃曲霉毒素總量最高達856 μg/kg。巴戟天中樣品AFB1和AFB2的陽性率均為20%，總量最高為2.01 μg/kg。砂仁樣品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的陽性率均為20%，總量最高為0.56 μg/kg。

3結(jié)論

藥材在生產(chǎn)、加工、貯藏、運輸?shù)倪^程中，容易發(fā)生霉變而產(chǎn)生黃曲霉毒素。我國對外貿(mào)易合作部發(fā)布的藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準（2001年第4號文）規(guī)定部分藥材中黃曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg；香港特區(qū)政府衛(wèi)生署公布的中藥材參考標準中規(guī)定黃曲霉毒素AFB1≤5 μg/kg，總量≤10 μg/kg；歐洲藥典（EP 6.2）規(guī)定黃曲霉毒素AFB1≤2 μg/kg，總量≤4 μg/kg。按照韓國新的許可標準，中藥材中黃曲霉毒素AFB1的含量必須低于10 μg/kg。該項目所建立的四大南藥中黃曲霉毒素分析方法，該方法的檢出限（LOD）為0.2～0.5 μg/kg，完全滿足各國規(guī)定的藥材中黃曲霉毒素的限量要求；線性范圍為0～50 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2均大于0999。在2～50 μg/kg的添加水平上，4種霉菌毒素平均回收率為78.6%～92.1%，相對標準偏差RSD為0.8%～84%。利用該方法對四大南藥樣品進行了分析，樣品中黃曲霉毒素AFB1均未超標，但部分藥材中黃曲霉毒素總量有超出歐洲藥典的限量標準。建議有關(guān)部門盡快制定我國藥材中黃曲霉毒素AFB1以及總量的限量標準，以加強對藥材的管理。

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