張春平等

[目的]通過(guò)對(duì)黃連種子萌發(fā)及幼苗生理特性的研究，尋找提高黃連種子及幼苗在鹽脅迫條件下抗性能力的途徑。[方法]用100 mmol/L的NaCl模擬鹽脅迫，在外源水楊酸（SA）處理后，對(duì)黃連種子的發(fā)芽勢(shì)（Gv）、發(fā)芽率（Gr）、發(fā)芽指數(shù)（Gi）、活力指數(shù)（Vi），以及黃連幼苗葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性、O2-· 產(chǎn)生速率、H2O2含量、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸及丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT） 和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果] NaCl脅迫下的黃連種子萌發(fā)受到顯著抑制，但在經(jīng)過(guò)不同濃度的SA處理后，各萌發(fā)指標(biāo)均有升高。試驗(yàn)結(jié)果表明，外源SA處理顯著提高了黃連種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)，明顯提高了鹽脅迫下黃連幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，不同程度地提高了葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，顯著降低了葉片丙二醛（MDA）含量、質(zhì)膜透性、O2-· 產(chǎn)生速率及H2O2含量。[結(jié)論]外源SA通過(guò)提高黃連種子的萌發(fā)指數(shù)，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性，降低細(xì)胞質(zhì)膜氧化程度，有效地減緩NaCl 脅迫對(duì)黃連種子及幼苗產(chǎn)生的傷害，提高了種子及幼苗的抗鹽能力。

關(guān)鍵詞黃連；亞精胺；鹽脅迫；種子萌發(fā)；生理特性

Abstract[Objective] In order to get the method of improving the salt resistance of seeds and seedlings for Coptis chinensis Franch. under NaCl stress， seed germination and physiological characteristics of C. chinensis seedlings were studied. [Method] Several physiological indexes of C. chinensis seeds and seedlings treated by exogenous salicylic acid under NaCl stress like the germination vigor， germination rate， germination index and vigor index were measured. And other indexes like the memberane permeability， H2O2 content， production rate of O2-， the contents of soluble surge， soluble protein， free proline， and malondialdehyde （MDA）， the activities of superoxide （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and ascorbate peroxidase （APX） were also measured. The germination indexes of C. chinensis seeds under NaCl stress have an obvious inhibition. But after the treatment of salicylic acid， every germination indexes were all increased. [Result] The result showed that the treatment of exogenous salicylic acid obviously improved the germination vigor， germination rate， germination index and vigor index， increased the content of soluble sugars， free proline， and soluble protein， decreased the content of malondialdehyde （MDA）， H2O2 content， production rate of O2-· Meanwhile， the results also indicated that salicylic acid improve the activities of superoxide （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and ascorbate peroxidase （APX）. [Conclusion] Exogenous salicylic acid with appropriate concentration could significantly alleviate the damages to the seeds and seedlings of C. chinensis under NaCl stress and promote the salt resistance of the seeds and seedlings through improve the germination indexes and antioxidase activities， decrease the memberane permeability and so on.

Key wordsCoptis chinensis Franch.； Spermidine； Salt stress； Seed germination； Physiological characteristics

黃連Coptis chinensis Franch.又名味連、川黃連、雞爪連，為毛茛科黃連屬多年生草本植物，三級(jí)漸危種[1]。野生黃連大多分布于四川、重慶、湖南、湖北、陜西、貴州省海拔1 200～1 700 m的山谷密林之中。黃連性寒、味苦，根莖入藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒等作用[2]，臨床上還用于細(xì)菌性痢疾、局部化膿性感染、心律失常、胃炎及十二指腸潰瘍等病的治療[3]。由于黃連根莖有效成分小檗堿的獨(dú)特藥效，使得藥材市場(chǎng)對(duì)其需求量逐年增加，目前對(duì)黃連的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用及資源保護(hù)等方面[4-5]。對(duì)黃連栽培過(guò)程中的環(huán)境脅迫主要集中在熱脅迫、冷脅迫、干旱脅迫等方面，但對(duì)鹽脅迫的報(bào)道較少，且對(duì)外源性物質(zhì)處理緩解脅迫的報(bào)道僅見于極少量文獻(xiàn)[6]。

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)栽培生產(chǎn)中主要障礙之一，目前我國(guó)的鹽漬土地面積不斷擴(kuò)大，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。水楊酸（SA）屬苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)物，屬于肉桂酸的衍生物，被認(rèn)為是一種內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)和新型植物激素，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、抗熱性、耐寒性和抗旱性，影響根部對(duì)離子的吸收和運(yùn)輸，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡。但在調(diào)控植物抗鹽脅迫中鮮見報(bào)道。該研究以黃連種子和幼苗為材料，研究亞精胺（Spd）對(duì)NaCl脅迫下的黃連若干生理生化指標(biāo)的影響，找到Spd對(duì)鹽脅迫的緩解調(diào)節(jié)機(jī)制，為黃連在栽培生產(chǎn)中遇到的鹽脅迫問(wèn)題提供理論依據(jù)和解決方法。

1材料與方法

1.1 材料

供試的黃連種子及兩年期黃連幼苗均由重慶石柱黃連培育基地提供，經(jīng)西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院何平教授鑒定為C. chinensis Franch.的干燥成熟種子。亞精胺（Spd）為Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1

種子萌發(fā)生理指標(biāo)的測(cè)定。

挑取籽粒飽滿、大小一致的黃連種子，用1.0%的次氯酸鈉（NaClO）溶液消毒處理5 min，蒸餾水沖洗3～5次，將種子表面水分用濾紙吸干，以鋪有雙層濾紙和雙層紗布的培養(yǎng)皿為發(fā)芽床，進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)。脅迫所用的NaCl濃度為100 mmol/L，試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理，即水對(duì)照（CK）、100 mmol/L的NaCl鹽處理（S）、100 mmol/L NaCl +5 mg/L SA（T1）、100 mmol/L NaCl +10 mg/L SA（T2）、100 mmol/L NaCl +20 mmol/L SA（T3）、100 mmol/L NaCl +50 mmol/L SA（T4）。在處理黃連種子時(shí)，處理液澆透培養(yǎng)皿底部，再覆蓋浸透處理液的濾紙，然后吸取培養(yǎng)皿多余的處理液，以免種子被處理液掩埋而影響萌發(fā)，種子在培養(yǎng)箱中進(jìn)行（23±2）/（ 15±2） ℃（晝/夜）的變溫培養(yǎng)，光照時(shí)間設(shè)為12 h/12 h（晝/夜），光照強(qiáng)度為2 500 lx。每個(gè)培養(yǎng)皿100粒種子，4次重復(fù)，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，第28天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)（Gv），第40天計(jì)算發(fā)芽率（Gr）、發(fā)芽指數(shù)（Gi）和活力指數(shù)（Vi）。計(jì)算公式分別為發(fā)芽勢(shì)（Gv）= （28 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試的所有種子數(shù)）×100%、發(fā)芽率（Gr）=（40 d內(nèi)發(fā)芽的種子/供試的所有種子數(shù)）×100%、發(fā)芽指數(shù)（Gi）=∑ （Gt/Dt）、活力指數(shù)（Vi）=S×∑ （Gt/Dt），式中，Gt為t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，S為植株的平均鮮重。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年

1.2.2

幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的兩年期幼苗移入小花盆中，每盆植入一株，盆中基質(zhì)按松針土

∶腐殖土∶沙土=2∶2∶1的比例混合形成。經(jīng)過(guò)10 d的緩苗期后，進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)，共設(shè)置6個(gè)處理，即Hoagland營(yíng)養(yǎng)液空白對(duì)照（CK）、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl鹽處理（S）、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +10 mg/L SA（T1）、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +25 mg/L SA（T2）、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +50 mg/L SA（T3）、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +100 mg/L SA（T4），每個(gè)處理10株幼苗，3次重復(fù)，每天定期向花盆內(nèi)補(bǔ)充Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。分別于鹽脅迫后的第5、第10和第15天進(jìn)行取樣，取樣時(shí)選取植株中等大小的功能葉片。測(cè)量的相關(guān)指標(biāo)包括幼苗葉片質(zhì)膜透性、質(zhì)膜氧化程度（丙二醛含量、O2-·產(chǎn)生速率及H2O2含量）、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶 （APX）的活性。 可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量均采用張志良等的方法[7]進(jìn)行測(cè)量，含量分別以mg/（g·FW）、mg/（g·FW）和μg/（g·FW）來(lái)表示。黃連幼苗葉片的原生質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)儀法測(cè)定[8]，以相對(duì)電導(dǎo)率來(lái)表示細(xì)胞膜受脅迫傷害的程度，相對(duì)電導(dǎo)率=未煮之前的電導(dǎo)率/煮沸后的電導(dǎo)率×100%，測(cè)量用電導(dǎo)儀型號(hào)為L(zhǎng)IDA DDS-307W。H2O2含量采用Lee等的方法[9]進(jìn)行測(cè)定，在436 nm 下測(cè)量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，單位為μmol/（g·FW）。

O2-· 產(chǎn)生速率采用張志良等的方法[10]進(jìn)行測(cè)定，在530 nm處的吸光值，單位為μmol/（g·min·FW）。

丙二醛（MDA）含量參照Velikova等的硫代巴比妥酸（TBA）檢測(cè)法[11]，分別于532和600 nm處檢測(cè)吸光度，以μmol/（g·FW）表示丙二醛含量。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定采用Xu等的方法[12]，在560 nm處檢測(cè)吸光度，單位為U/（mg·protein）；過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)量方法采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)量[13]，檢測(cè)波長(zhǎng)為465 nm，單位為U/（mg·protein）；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)量方法采用Dhindsa等的方法[14]，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，單位為U/（mg·protein）；抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性的測(cè)量方法采用Nakano等的方法[15]，于290 nm處檢測(cè)吸光度，單位為U/（mg·protein）。

1.2.3

數(shù)據(jù)處理。采用SSPS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以Duncans新復(fù)級(jí)差法比較不同處理間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對(duì)鹽脅迫下黃連種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，黃連種子在不同的處理下，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有不同程度的變化；與未經(jīng)任何處理（CK）的發(fā)芽勢(shì)（55.36%）和發(fā)芽率（78.49%）相比，100 mmol/L的NaCl處理（S）的種子發(fā)芽勢(shì)（25.17%）和發(fā)芽率（39.22%）顯著降低，表明NaCl處理顯著抑制了黃連種子的正常萌發(fā)；當(dāng)用不同濃度的SA處理后，黃連種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與NaCl處理（S）相比均有不同程度的提高，其中經(jīng)過(guò)10 mg/L的SA處理后（T2）的結(jié)果最為顯著，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率達(dá)52.21%和76.00%，與其余各SA處理相比差異顯著。發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化趨勢(shì)與發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的變化相似，經(jīng)過(guò)NaCl處理后，發(fā)芽指數(shù)也顯著降低，但經(jīng)過(guò)不同濃度的SA處理后，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有明顯的升高，且也是在經(jīng)過(guò)10 mg/L的SA處理后結(jié)果最為顯著，發(fā)芽指數(shù)（32.30）和活力指數(shù)（370.00）達(dá)最大，顯著高于鹽處理S（16.37和180.39），分別為S處理的1.97和2.05倍，比空白對(duì)照（CK）略低，但差異不顯著。說(shuō)明適宜濃度的SA可有效緩解鹽脅迫對(duì)黃連種子萌發(fā)造成的傷害，在提高黃連種子各萌發(fā)生理指標(biāo)中具有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。

2.2SA對(duì)鹽脅迫下黃連幼苗葉片細(xì)胞膜脂過(guò)氧化及質(zhì)膜透性的影響

從鹽脅迫下黃連葉片O2-·產(chǎn)生速率及H2O2含量的變化（圖2a、b）可看出，經(jīng)過(guò)NaCl進(jìn)行脅迫后，兩者均有

不同程度的升高；在脅迫初期，兩者水平與對(duì)照組CK相比均發(fā)生顯著升高，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，提高幅度不斷變大；

當(dāng)用外源SA進(jìn)行處理后，兩者均有不同程度的降低。SA在處理初期對(duì)O2-·產(chǎn)生速率的影響表現(xiàn)為低濃度處理效果并不明顯，但隨著濃度的升高，效果越來(lái)越明顯，在濃度為50 mg/L時(shí)（T3）時(shí)降到最小值[1.290 μmol/（g·min·FW）]，且低于空白對(duì)照CK[1.249 μμmol/（g·min·FW）]。在SA處理初期，H2O2含量有明顯的降低，且同樣在濃度為50 mg/L時(shí)（T3）達(dá)最小值[1.43 μmol（g·FW）]，接近于空白對(duì)照CK[1.32 μmol/（g·FW）]，說(shuō)明SA顯著地緩解了鹽脅迫下黃連葉片H2O2含量升高的趨勢(shì)。由鹽脅迫下丙二醛（MDA）含量的變化（圖2c）可見，未經(jīng)任何處理的黃連葉片MDA含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)并無(wú)顯著變化，而經(jīng)過(guò)NaCl處理后（S）的黃連葉片MDA含量自脅迫初期便呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢(shì)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，升高的幅度不斷增大。在經(jīng)過(guò)SA處理后，含量均有顯著降低，處理前期（T3，5 d）達(dá)最低值[0.081 μmol/（g·FW）]。鹽脅迫初期電導(dǎo)率隨著脅迫程度和時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，并在脅迫后期（15 d）達(dá)到最大，在經(jīng)過(guò)SA處理后均有不同程度的降低（圖2d）。以上結(jié)果表明在鹽脅迫下，黃連葉片細(xì)胞膜透性發(fā)生了改變，從而引起部分離子外流，導(dǎo)致電導(dǎo)率發(fā)生了變化。在經(jīng)過(guò)Spd處理后，顯著地降低了鹽脅迫下黃連葉片的相對(duì)電導(dǎo)率水平，保護(hù)了葉片細(xì)胞，維持了細(xì)胞膜的相對(duì)穩(wěn)定性。

2.3SA對(duì)鹽脅迫下黃連幼苗葉片滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

從不同處理鹽脅迫下黃連幼苗葉片可溶性糖含量的變化趨勢(shì)（圖3a）可看出，可溶性糖含量與對(duì)照CK相比，呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，且差異顯著，但隨著NaCl處理時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖含量升高的趨勢(shì)并不明顯；當(dāng)用外源Spd進(jìn)行處理后，可溶性糖含量均有不同程度的變化，SA處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢(shì)，且在處理后期（10 d），處理濃度為50 mg/L（T3）時(shí)達(dá)最大值16.90 mg/（g·FW），與鹽處理S[13.92 mg/（g·FW）]形成顯著性差異。脯氨酸含量的變化與可溶性糖趨勢(shì)基本一致，均是在未經(jīng)處理前含量最低，經(jīng)過(guò)鹽脅迫后，含量有所增加；但經(jīng)過(guò)外源SA處理后，增加幅度顯著提高，使葉片內(nèi)積累了大量的滲透性物質(zhì)，以抵抗鹽脅迫對(duì)葉片造成的傷害（圖3c）?？扇苄缘鞍自邴}脅迫下呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，但經(jīng)過(guò)SA處理后，呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢(shì)，與鹽脅迫處理S相比，差異顯著，外源SA有效地減緩了葉片內(nèi)可溶性蛋白減少的趨勢(shì)，增加了可溶性蛋白的含量（圖3b）。

2.4 SA對(duì)鹽脅迫下黃連幼苗葉片4種抗氧化酶活性的影響

從圖4可以看出，在經(jīng)過(guò)鹽脅迫后，4種抗氧化酶的活性均有不同程度的提高，說(shuō)明黃連幼苗對(duì)脅迫的反應(yīng)比較明顯。但4種酶的具體變化規(guī)律并不完全相同，在受到鹽脅迫后，隨著脅迫時(shí)間的推移，SOD和APX呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，而POD和CAT則呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)。在經(jīng)過(guò)外源處理SA后，4種抗氧化酶的活性均呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢(shì)，并與空白對(duì)照CK和鹽處理S形成顯著差異，且當(dāng)SA濃度達(dá)50 mg/L（T3）時(shí)，其效果最好。SOD、POD、CAT、APX 4種抗氧化酶的活性均在第15天時(shí)達(dá)最大值，分別為811.01、89.76、9.86和1.75 U/（mg·protein）。說(shuō)明外源SA顯著地提高了4種抗氧化酶的活性，用于減輕細(xì)胞氧化程度，維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)，且具有一定的持續(xù)作用。

3 討論

鹽脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加，質(zhì)膜透性可以反映植物細(xì)胞膜的破損程度，而 MDA 是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞膜具有毒害作用，是衡量植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度大小的最常用指標(biāo)。該試驗(yàn)中，NaCl處理造成黃連幼苗葉片質(zhì)膜透性和 MDA 含量均高于對(duì)照處理，表明鹽脅迫能使植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，膜透性增加，加劇植物的氧化損傷。但當(dāng)用外源SA處理以后，MDA含量顯著降低，說(shuō)明SA對(duì)減緩鹽脅迫所造成的傷害具有積極的緩解作用，通過(guò)外源物質(zhì)的處理，有效地降低了H2O2含量及O2-·的產(chǎn)生速率，緩解了兩者對(duì)細(xì)胞膜造成的氧化傷害，從而降低了細(xì)胞膜的透性。

SOD、POD、CAT和APX 是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的4個(gè)重要保護(hù)酶，這些酶類共同作用維持細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡，從而使需氧生物體免受傷害。該研究中，在經(jīng)過(guò)SA處理后，黃連幼苗葉片中4種抗氧化酶均表現(xiàn)出明顯的變化，但變化趨勢(shì)略有不同，說(shuō)明4種酶在遇到脅迫時(shí)具有不同的分工，在經(jīng)過(guò)外源SA處理以后，4種酶的活性大幅度升高以抵抗過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的傷害，有效地清除因?yàn)槟べ|(zhì)過(guò)氧化積累下來(lái)的活性氧，以實(shí)現(xiàn)緩解氧化的目標(biāo)。該試驗(yàn)結(jié)果也證明了外源SA通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶活性來(lái)降低活性氧水平，減輕氧化脅迫對(duì)黃連幼苗造成的傷害。

SA通常被認(rèn)為是植物在逆境脅迫反應(yīng)中產(chǎn)生的一種信號(hào)分子，其作用機(jī)理之一可能就是SA抑制了MDA累積引起的膜脂過(guò)氧化，保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與SA對(duì)小麥鹽害及水分脅迫的緩解作用機(jī)理相似[16]。研究表明，100～200 mg/L的SA在緩解甜瓜鹽害中的作用較明顯，這與宋士清等在黃瓜幼苗中的研究結(jié)果[17-18]相符合。李兆亮等分析發(fā)現(xiàn)非鹽脅迫下SA對(duì)CAT活性有微弱的抑制作用[19]。在該研究中，鹽脅迫條件下，外源SA對(duì)CAT活性有明顯的促進(jìn)作用，這可能與SA濃度及鹽脅迫條件有關(guān)。

綜上所述，SA通過(guò)提高鹽脅迫下黃連幼苗的抗氧化酶活性，加強(qiáng)清除活性氧能力，增加膜穩(wěn)定性，降低細(xì)胞滲透勢(shì)，減少膜質(zhì)過(guò)氧化作用，從而緩解黃連幼苗所受的氧化損傷，增強(qiáng)了其抗鹽性。

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