王超 曲曉軍 崔艷華

摘要cDNAAFLP技術(shù)是一種在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因差異表達(dá)的分子生物學(xué)實驗技術(shù)，由于其具有起始材料量少、假陽性低、重現(xiàn)性、靈敏度高且不需預(yù)先知曉序列信息等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各類生物差異表達(dá)基因的研究。

關(guān)鍵詞cDNAAFLP；基因差異表達(dá)；技術(shù)特點；應(yīng)用

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）21-06937-04

cDNAAFLP Technology and Its Application in Gene Differential Expression

WANG Chao， CUI Yanhua et al （School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract cDNAAFLP is a kind of molecular biological experimental technology which detects differential expression of genes at the transcriptional level. Due to its little material， low false positive， high repeatability， high sensitivity and less sequence information is widely used in various types of studies of biological gene differential expression. The basic principle， development history， technical characteristics and the potential application of cDNAAFLP technology in lactic acid bacteria fermentation was discussed.

Key words cDNAAFLP； Differential gene expression； Technical characteristics； Application

基金項目國家自然科學(xué)基金資助項目（30901048）。

作者簡介王超（1989- ），女，黑龍江佳木斯人，碩士生研究生，研究方向：分子微生物學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事分子微生物學(xué)方面的研究。

收稿日期20140623基因的差異表達(dá)是調(diào)控細(xì)胞生命活動的核心機(jī)制[1]。目前，在轉(zhuǎn)錄水平上，對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選分析的方法主要包括Northern雜交、基因芯片技術(shù)（DNA chip technique）、消減雜交（subtractive hybridization）、差示篩選（differential screening）、mRNA差異顯示PCR（Differential Display Reverse Transcription PCR，DDRTPCR）、DNA微陣列（microarray）分析、基因表達(dá)系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）及cDNAAFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism，cDNAAFLP）等。其中基因芯片技術(shù)、SAGE和cDNAAFLP可對生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大規(guī)模全面系統(tǒng)分析。基因芯片是當(dāng)前確定基因差異表達(dá)的常用技術(shù)之一，但利用該技術(shù)的前提條件是熟悉所研究對象的遺傳背景，同時該技術(shù)對于低豐度的基因往往難以檢測。另外該技術(shù)需要昂貴的設(shè)備和高昂的試驗成本，一般實驗室難以完成。

cDNAAFLP技術(shù)可以對未知基因組序列的生物進(jìn)行基因差異表達(dá)研究。該技術(shù)最早廣泛用于植物基因差異表達(dá)研究，與基因芯片技術(shù)相比，cDNAAFLP技術(shù)操作簡單、不需要特殊儀器設(shè)備、成本相對低廉，且該技術(shù)的靈敏性和特異性可與基因芯片技術(shù)相比擬[2]。近年該技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，已成功用于巴西固氮螺菌、鼠李糖乳桿菌等多種微生物的基因研究[3-4]。cDNAAFLP技術(shù)在基因差異表達(dá)研究中日益顯示其顯著地優(yōu)勢，筆者就cDNAAFLP技術(shù)的基本原理、發(fā)展歷史、技術(shù)特點以及該技術(shù)在植物、微生物等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行闡述，并對該技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1cDNAAFLP技術(shù)的發(fā)展歷史與基本原理

cDNAAFLP技術(shù)是由AFLP（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)發(fā)展而來。AFLP技術(shù)由荷蘭Keygene公司的Zabeau和Vos等于1992年創(chuàng)建[5]，是RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。RFLP基本原理是由于DNA突變增加或減少了某些內(nèi)切酶位點，在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生大小不等的片段，從而反映出不同樣品DNA水平上的多態(tài)性。cDNAAFLP技術(shù)將RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）和AFLP [5]技術(shù)相結(jié)合，研究基因的差異表達(dá)。

cDNAAFLP的試驗流程大致可分為4步：①模板的制備和cDNA的合成。以純化的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA；②雙鏈cDNA片段雙酶切和人工接頭的連接。用識別序列分別為6和4 bp的2種限制性內(nèi)切酶，酶切雙鏈cDNA。獲得的酶切片段與人工接頭連接；限制性內(nèi)切酶的選擇主要取決于酶切位點出現(xiàn)的頻率；③酶切片段的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增；④聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，從而確定差異基因 [6-8] （圖1）。

1996年BACHEM等[6]首次應(yīng)用cDNAAFLP技術(shù)研究了土豆塊莖形成過程中的基因表達(dá)過程。研究者研究了儲存蛋白Patatin和編碼ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。分析結(jié)果與Northern分析的結(jié)論一致，證實了cDNAAFLP研究發(fā)育調(diào)控基因的可行性。同年，MONEY等[9]首次在小麥上應(yīng)用了該技術(shù)，說明cDNAAFLP技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用范圍。1998年BACHEM等[10]深入研究了cDNAAFLP技術(shù)的影響因素，分析了PCR循環(huán)數(shù)目及模板稀釋水平對反應(yīng)的影響，檢測了擴(kuò)增中Mg2+濃度的影響作用。此方法最早應(yīng)用于植物中[3]，目前國內(nèi)外已應(yīng)用于羅薩花、水稻、番茄、紅花、棉花[11-15]等植物抗旱性、耐鹽性、抗病蟲性、發(fā)育不同時期基因表達(dá)等的研究。隨著該技術(shù)的完善和發(fā)展，近年來該技術(shù)也應(yīng)用于動物、微生物等方面研究，如用于昆蟲基因表達(dá)差異性研究等[16]。HENRIQUEZ等[17]使用消減雜交和cDNAAFLP結(jié)合的方法鑒定和克隆參與馬鈴薯和馬鈴薯晚疫病菌之間相互作用而差異表達(dá)的基因，在分析細(xì)菌的基因表達(dá)圖譜方面取得了一定成果。

圖1cDNAAFLP試驗流程42卷21期王 超等cDNAAFLP技術(shù)及其在基因差異表達(dá)中的應(yīng)用2cDNA –AFLP技術(shù)特點

2.1重復(fù)性好，假陽性低，可檢測低豐度表達(dá)的mRNAcDNAAFLP對PCR模板和條件的要求不高，一般用2個選擇性堿基即可得到較穩(wěn)定的差異片段。如果增加1個選擇性堿基，可進(jìn)一步減少擴(kuò)增出片段的假陽性。因試驗中經(jīng)過2次PCR擴(kuò)增，表達(dá)量較低的mRNA也易被檢測出來，大大提高了反應(yīng)的靈敏性[18]。當(dāng)高通量測序不可用時，用改進(jìn)的、成本效益好的cDNAAFLP探討轉(zhuǎn)錄獲得的產(chǎn)品。雖然高通量測序成本正在減少，往往對于個體項目目標(biāo)成本仍較高，如在非模式生物全基因組轉(zhuǎn)錄的研究中。要排除重復(fù)的PCR，克隆和廣泛存在重疊的轉(zhuǎn)錄，這些都會降低方法的效率[19]。

2.2反映基因之間表達(dá)量的區(qū)別cDNAAFLP技術(shù)由于其反應(yīng)條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，擴(kuò)增產(chǎn)物的水平依賴于單個模板的濃度，故可對基因組的表達(dá)量呈現(xiàn)一個可靠的結(jié)果[6]。LI等[3]采用cDNAAFLP技術(shù)檢測與固氮螺菌細(xì)胞趨化和包囊有關(guān)基因表達(dá)的差異，結(jié)果顯示3個不同的TDFs（AB46，AB58和AB63）與聚羥基丁酸酯解聚酶的C 末端、細(xì)胞形狀決定蛋白質(zhì)及鞭毛域蛋白存在同源性。11個TDFs顯示與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白存在同源性，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白包括與氮調(diào)節(jié)蛋白NtrY同源的蛋白及硝酸鹽/亞硝酸鹽反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，這些基因表達(dá)量之間的差異被準(zhǔn)確反映出來。

2.3全面獲取轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)信息據(jù)推測，植物基因組中可編碼16 000～33 000個基因。若選擇合適的酶切組合進(jìn)行分析，幾乎所有的表達(dá)基因包括表達(dá)量極低的基因均可用cDNAAFLP技術(shù)檢測到。一般cDNAAFLP擴(kuò)增片段的大小在100～1 000 bp，平均每對引物能擴(kuò)增出約50條譜帶。因此，利用一對合適的內(nèi)切酶組合和256對引物即可得到約13 000條帶，所提供的信息量大，對于生物某個特定組織或者發(fā)育階段而言，能夠較全面地獲取轉(zhuǎn)錄組的信息。SILVA 等[20]采用cDNAAFLP分析揭示了植物黃單胞菌全基因組。

2.4分析樣品所需量少預(yù)擴(kuò)增過程為選擇性擴(kuò)增提供了大量充足的模板，這也是cDNAAFLP只需要很少起始材料即可進(jìn)行的原因。且cDNAAFLP所用的原始材料量極少，每份樣品100～200 mg，便可進(jìn)行cDNAAFLP的飽和篩選，即便是較難獲得樣品的組織如花粉粒、線粒體、葉綠體等也能適用。用AFLP分析DNA時，需要有3個選擇性堿基[5]，而cDNA相對簡單，利用2個選擇性堿基即可。這大大擴(kuò)大了cDNAAFLP技術(shù)的適用范圍，這也是該技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的重要原因之一。

3cDNAAFLP技術(shù)的應(yīng)用

3.1基因的表達(dá)與調(diào)控研究研究者通過cDNAAFLP技術(shù)研究基因不同時空的表達(dá)情況，降低了經(jīng)典mRNA差異顯示技術(shù)的假陽性，同時對低水平表達(dá)基因更敏感，并使操作更安全。

LEYMARIE等[21]研究大麥種子休眠和非休眠胚胎的差異表達(dá)從而闡明休眠的分子調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，39個TDFs差異表達(dá)，其中25個被克隆和測序。8個在后熟過程中差異表達(dá)，其中7個下降，可能是由于后熟降解。確定其中一個轉(zhuǎn)錄表達(dá)片段hv13b與果糖6磷酸2激酶/果糖2，6二磷酸酶具有同源性，可能對于維持休眠大麥或者其他可能谷物有作用。BOTTON等[22]研究炭黑曲霉生產(chǎn)的赭曲霉毒素，對2株炭黑曲霉進(jìn)行了cDNAAFLP差異顯示篩選，結(jié)果表明，抑制菌種生產(chǎn)能力的基因包含 119個差異表達(dá)序列，這些差異序列不同程度地參與赭曲霉毒素生物合成的調(diào)節(jié)。LIN等[23]研究發(fā)現(xiàn)對于苜蓿中華根瘤菌堿性應(yīng)力和鉀運輸調(diào)控所必須的ABC載體，揭示了7個基因簇中前4個基因編碼假定的糖轉(zhuǎn)運三磷酸腺苷結(jié)合盒（ABC）載體的特征組分。存在鉀時，根瘤菌中調(diào)控鉀吸收的3個基因的轉(zhuǎn)錄，trkH，kdpA和kupI，在supA突變體中表達(dá)明顯減弱。BOVE等[4]研究奶酪中的鼠李糖乳桿菌的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用3對引物檢測該菌在MRS培養(yǎng)基中64個基因的表達(dá)及該菌在奶酪培養(yǎng)基中96個基因的表達(dá)。cDNAAFLP方法能夠證明鼠李糖乳桿菌很大一部分基因表達(dá)的變化。這是第一次通過cDNAAFLP技術(shù)從奶酪和少數(shù)有關(guān)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄分離得到的鼠李糖乳桿菌。

3.2分離特異表達(dá)基因分析基因表達(dá)的差異，尋找分子標(biāo)記的最終目的是為了分離基因以及研究該基因?qū)τ谏矬w個體發(fā)育的影響。

DELLAGEI等[24]采用cDNAAFLP分析原核植物軟腐病病原菌差異表達(dá)的基因，結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)水平，這些基因與油菜黃單胞菌無毒基因有很大的相似性。Northern分析確認(rèn)擴(kuò)增片段的差異片段均來自差異表達(dá)的基因。CAMPALANS等[25]鑒定脫水杏仁差異表達(dá)的基因，分析了對脫水杏仁強(qiáng)烈響應(yīng)的幾個基因。預(yù)測的多肽與蛋白質(zhì)序列表現(xiàn)出相似性，包括含氮化合物的轉(zhuǎn)運、1?；鵶n甘油3磷酸?；D(zhuǎn)移酶、低分子量熱休克蛋白、半胱氨酸蛋白酶和組成富含脯氨酸蛋白的表達(dá)。VALVERDE等[26]揭示了固氮螺菌2種菌株在細(xì)胞聚集過程中差異表達(dá)的相關(guān)基因，在高碳氮比誘導(dǎo)下，菌種在指數(shù)生長期有81個TDFs差異表達(dá)。將差異片段進(jìn)行測序和分析，通過RTPCR比較野生型Sp7和 Sp72002菌株（含有一個能誘發(fā)flca-突變的TN5，不聚集，不區(qū)分運動，囊腫樣，在其細(xì)胞表面缺乏一些多糖），獲得了編碼10種已知蛋白質(zhì)基因的表達(dá)情況。

3.3毒性、耐受性研究cDNAAFLP技術(shù)可以應(yīng)用于植物抗性品系和敏感品系在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上的比較，篩選抗病蟲害的基因，研究結(jié)果可以幫助闡明抗性品系的分子機(jī)制，以應(yīng)用于抗病育種研究中。SZCZESNY等[27]采用該技術(shù)研究了植物病原細(xì)菌——黃單胞菌分泌系統(tǒng)Xcs和Xps的功能特性。轉(zhuǎn)錄分析表明，Xcv（植物病原菌中的xpst2s系統(tǒng)所分泌，促進(jìn)疾病發(fā)生并有助于效應(yīng)蛋白的易位，通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3S）輸送到植物細(xì)胞）的基因表達(dá)譜是由T3S系統(tǒng)的主要調(diào)控因子hrpg和hrpx激活。xynC（是與毒力相關(guān)的木聚糖酶，Xps系統(tǒng)的基質(zhì)）、細(xì)胞外蛋白酶和木聚糖酶活動的表達(dá)受到hrpg和hrpx的抑制，這表明Xps系統(tǒng)的組件和基質(zhì)的調(diào)節(jié)存在差異。

目前，許多植物對于重金屬的耐受性都是通過cDNAAFLP技術(shù)進(jìn)行研究的。如CHAO等[28]、CICATELLI等[29]分析鋅、銅誘導(dǎo)下植物基因的表達(dá)。另外，cDNAAFLP技術(shù)對于植物致病菌相關(guān)基因的研究也取得了一定進(jìn)展。ELBEBANY等[30]研究誘導(dǎo)馬鈴薯根提取物中黃萎病致病的相關(guān)基因。

3.4構(gòu)建轉(zhuǎn)錄連鎖圖LI等[31]構(gòu)建了太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的遺傳連鎖圖譜，為定位重要的經(jīng)濟(jì)性狀基因及最終實現(xiàn)太平洋牡蠣的標(biāo)記輔助選育和遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。目前，許多水產(chǎn)生物的基因連鎖圖譜都是采用該技術(shù)加以構(gòu)建的。如日本對蝦（Marsupenaeu japonicus）[32]、皺紋盤鮑（Haliotisdiscus hannai）[33]和條斑紫菜[34]等。QIN等[35]發(fā)明了一種計算機(jī)程序GenEST，實現(xiàn)了EST序列與cDNAAFLP基因表達(dá)信息的雙向連接和轉(zhuǎn)化。

4小結(jié)與展望

cDNAAFLP技術(shù)在研究植物差異表達(dá)基因方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，隨著近年來該技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用范圍已經(jīng)逐漸擴(kuò)展至微生物中差異表達(dá)基因的研究。微生物具有結(jié)構(gòu)簡單、繁殖速度快、變異易識別、研究周期短、進(jìn)展迅速的特點，因此，微生物是研究生物進(jìn)化的良好材料。通過cDNAAFLP技術(shù)對其基因組的研究分析，將為揭示一系列諸如生命起源、生物發(fā)育和進(jìn)化等生命活動的重大基本問題提供極大的幫助。乳酸菌廣泛存在于自然界，與人類關(guān)系密切，其中部分乳酸菌為益生菌。當(dāng)前乳酸菌研究主要集中在發(fā)酵、生理特性等方面。近年來大量有益乳酸菌基因組序列的完成，為從分子水平上研究乳酸菌提供了大量的信息，為cDNAAFLP技術(shù)在乳酸菌的應(yīng)用提供了平臺。cDNAAFLP技術(shù)能夠在轉(zhuǎn)錄水平全面系統(tǒng)地獲取乳酸菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息，有利于在分子水平上獲悉乳酸菌的代謝機(jī)制，尤其是發(fā)酵過程中的整體變化，進(jìn)而促進(jìn)乳酸菌的應(yīng)用。

綜上所述，cDNAAFLP技術(shù)自誕生之后，在很多研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。cDNAAFLP技術(shù)已逐漸成為研究基因差異表達(dá)行之有效的方法，是研究功能基因組的新方法、新手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，以及技術(shù)間相互結(jié)合使用、優(yōu)化，該技術(shù)必將具有更旺盛的生命力，相信該技術(shù)在基因差異表達(dá)研究中具有巨大的潛在應(yīng)用價值。

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