張風(fēng)林 張振安 張靜

【摘 要】目的：研究Survivin基因沉默對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和對(duì)化療藥物吉非替尼敏感性的影響。方法：設(shè)計(jì)合成survivin的siRNA序列，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞。采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)survivin在干擾后mRNA和蛋白的表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。通過(guò)MTT法和細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)法察survivin基因沉默后A549細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。結(jié)果：Survivin基因沉默48h后，A549細(xì)胞的survivin基因和蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。survivin基因沉默組細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性顯著性增強(qiáng)。結(jié)論：特異性siRNA介導(dǎo)的Survivin使細(xì)胞A549增殖減少，增強(qiáng)其對(duì)易瑞沙的敏感性。

【關(guān)鍵詞】Survivin；siRNA；肺腺癌；A549細(xì)胞；細(xì)胞增殖；吉非替尼

【中圖分類(lèi)號(hào)】R394 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）03-01113-02

肺癌位居我國(guó)惡性腫瘤死亡原因的首位，占全部惡性腫瘤死亡原因的22.7%。我國(guó)目前肺癌發(fā)病率每年增長(zhǎng)26.9%，預(yù)計(jì)到2025年，我國(guó)的肺癌患者將達(dá)100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)[1]。肺癌對(duì)人們健康造成很大危害，本文通過(guò)將合成的siRNA轉(zhuǎn)染入肺腺癌A549細(xì)胞，分析siRNA對(duì)其Survivin基因沉默的效率；Survivin基因被沉默后對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及其對(duì)吉非替的敏感性的影響。為RNA干擾Survivin基因治療肺癌或做為增敏藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要材料

肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞究所。MI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RT-PCR兩步法試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)， cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)； siRNA基因片段由上海生工生物工程公司合成；G418購(gòu)自美國(guó)Klontech公司；Survivin鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；5%四甲基偶氮唑藍(lán)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉公司；吉非替尼（AstraZeneca UK Limited）；流式細(xì)胞儀（COULTER XL; Coulter）；550酶標(biāo)儀（美國(guó)Biorad公司），生物倒置顯微鏡（Olympus CKX4）。ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自江蘇碧云天公司。

1.2siRNA設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染

根據(jù)Genebank中 Survivin cDNA (Acc.No.U75285)的序列 ,通過(guò)相應(yīng)計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)靶向 survivin mRNA 45- 65序列，由21個(gè)堿基組成的核苷酸鏈,其序列為: 5-GG ACCACCGCAUCUCUACADTDT- 3 ,同時(shí)合成互補(bǔ)鏈 ,經(jīng)退火形成雙鏈 ( dsRNA) ,即特異性 的siRNA分子，經(jīng)BLAST查詢(xún) ,確定為 survivin特性序列 ,排除與其他基因的同源性。陰性對(duì)照 siRNA的序列為:5- CGUACGCGGAAUACUUCG ADTDT-3 ,此序列不與人類(lèi)任何基因序列同源。以上核苷酸分子均由上海生工生物工程公司合成。肺腺癌細(xì)胞株A549 培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。按1 × 10 5個(gè)／孔將肺A549細(xì)胞接種于24孔板中，至融合率達(dá)70％時(shí)以脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按基因轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)分為3組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1-survivin-siRNA載體者為A549／survivin-siRNA組(實(shí)驗(yàn)組)，轉(zhuǎn)染隨機(jī)對(duì)照載體者為A549／control組（對(duì)照組），未轉(zhuǎn)染的肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞為A549組（空白組）。于轉(zhuǎn)染后48h行 RNA 干擾效應(yīng)的檢測(cè)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，通過(guò)TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增Survivin和內(nèi)參GAPDH。Survivin引物序列:正義：5＇-CACCGCATCTCTACATTCAA-3＇，反義：5＇-CTCTTTCTTCGCAGTTTCCA-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為345bp。GAPDH 正義：5＇-GTGTCAACGGATTTGGTCGA-3＇， 反義：5＇-GACAAGSTTCCCGTTCT CAG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為180 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描并用Survivin吸光度/GAPDH吸光度值作為mRNA表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.4 Westem blot檢測(cè)

細(xì)胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液150 μL，RIPA裂解液預(yù)先加PMSF1.5 μL使其終濃度為1 mmol/L。操作在冰上進(jìn)行， 4 ℃下，10 000 r／min離心5 min后取上清液，通過(guò)BCA法測(cè)蛋白濃度后，99 ℃ 變性10 min。取50 μg蛋白行10%SDSPAGE電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上，封閉液中孵育1 h. 加入1∶1000稀釋的survivin一抗，4℃過(guò)夜. TBST洗膜5 min, 共3次. 加入1∶5000 HRP標(biāo)記的二抗和GAPDH, 于37℃孵育2 h. PBS洗滌，采用ECL法檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

收集三組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，冷PBS 洗滌2 次, 加入70 %的冷乙醇(4 ℃) 固定24 h后，洗滌細(xì)胞，與含10 μg/ ml RNA 酶的Tris-HCL緩沖液(pH7. 4) 共同孵育30 min。50μg/ ml 碘化丙啶( PI)進(jìn)行細(xì)胞的DNA 染色，1 h 內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的DNA含量分布，并計(jì)算出各個(gè)周期細(xì)胞所占的百分率。

1.6 MTT檢測(cè)干擾Survivin后A549對(duì)吉非替尼的敏感性

細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞， 接種于96孔板 ， 每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔， 當(dāng)細(xì)胞貼壁后，加 入不 同濃度的吉非替尼 (2.5、5、10 、20 μmol/ L )培養(yǎng)48 h ；每孔加MT T 20μl (濃度為5mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸鈉）200μl，過(guò)夜。震蕩15min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（檢測(cè)490nm處的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn)）/（A對(duì)照-A空白）×100%。

1.7平板克隆檢測(cè)干擾Survivin后A549對(duì)吉非替尼的敏感性

細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞， 接種于6孔板 ， 每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔， 細(xì)胞貼壁后，加入不 同濃度的吉非替尼 (2.5、5、10 、20 μmol/ L )培養(yǎng)中培養(yǎng)7天，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來(lái)水沖洗后，晾干，通過(guò)Quantity One軟件計(jì)算克隆數(shù)。克隆形成抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，兩組間連續(xù)變量比較用t檢驗(yàn)，多組間連續(xù)變量比較用方差分析，協(xié)方差校正，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 siRNA抑制Survivin mRNA的表達(dá)

Survivin mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)與A549／control組（對(duì)照組）和A549組（空白組）比較，A549／Survivin-siRNA組（實(shí)驗(yàn)組）條帶明顯變窄，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空白組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1

Fig.1 Detection of Survivin mRNA expression in A549 cells by RT-PCR

2.2siRNA抑制Survivin蛋白的表達(dá)

Survivin蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)與A549／control組（對(duì)照組）和A549組（空白組）比較，A549／Survivin-siRNA組（實(shí)驗(yàn)組）條帶明顯變窄， 其灰度值比較差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

流式細(xì)胞儀分析各組A549細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，在G0/G1期實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組和空白組略有增加，S期略有減少。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、空白組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M期細(xì)胞無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明有明顯的S期阻滯(表1)。

2.4 干擾Survivin后A549對(duì)吉非替尼的敏感性提高

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示， 在轉(zhuǎn)染pgsiRNA—Survivin后，A549細(xì)胞對(duì)不同濃度的吉非替尼敏感性均提高 。隨著藥物濃度的增加，吉非替尼對(duì)細(xì)胞的抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)不同濃度的吉非替尼敏感性顯著高對(duì)照組和空白組 (均P<0.05 ) ( 表 2 )。

2.5對(duì)A549細(xì)胞集落形成的影響

平板克隆檢測(cè)顯示， 轉(zhuǎn)染 pgsiRNA—Survivin后，A549細(xì)胞對(duì)不同濃度的吉非替尼敏感性均提高，細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少，克隆形成抑制率明顯增高(P<0.05 )。隨著藥物濃度的增加，吉非替尼對(duì)細(xì)胞的克隆形成抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)不同濃度的吉非替尼克隆形成抑制率顯著高于對(duì)照組和空白組 (均P<0.05 ) ( 表 3 )。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多種因素共同作用造成的，其中細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用。凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins ，IAPs)在抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到重要作用[2-3]。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的IAPs家族的成員之一，它具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的，幾乎表達(dá)在所有腫瘤細(xì)胞中,而在除胸腺外的正常成人組織中不表達(dá),它與腫瘤的凋亡、增殖及耐藥性的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系,是腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)[4-6]。Survivin在惡性腫瘤中具有較高的表達(dá)水平，和腫瘤的淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期等都有密切的關(guān)系。研究[7]顯示survivin是caspase3和caspase7的直接抑制因子，主要通過(guò)抑制Caspase3、Caspase7的活性，來(lái)阻斷細(xì)胞的凋亡過(guò)程，使Caspase3不能降解微管結(jié)構(gòu)蛋白，維持了紡綞體的完整性，可以確保胚胎細(xì)胞有絲分裂的順利進(jìn)行，而在腫瘤組織中survivin過(guò)度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞不斷分裂，惡性增殖永生化，使腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)。因此針對(duì)Survivin干預(yù)腫瘤生長(zhǎng)有著很大的潛力，有研究[8-9]報(bào)道干擾survivin基因后，對(duì)結(jié)腸癌有著較好的效果。對(duì)鼻咽癌也有類(lèi)似報(bào)道[10]。

吉非替尼是E G F R酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，EGFR—TKI)。當(dāng)EGFR與其配體 ( EGF，TGF-a ) 結(jié)合后被激活。介導(dǎo)著一系列的細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)，繼而促進(jìn)腫瘤形成和侵襲性生長(zhǎng)，EGFR表達(dá)增高提示腫瘤預(yù)后不良.吉非替尼是臨床應(yīng)用較早 EGFR—TKI，可特異性作用于腫瘤細(xì)胞，而對(duì)機(jī)體正常組織無(wú)毒或低毒，因而是理想的藥物。廣泛的應(yīng)用于上皮性腫瘤的治療及增敏中。有關(guān)吉非替尼治療肺癌的臨床研究[11-12]提示，其在特定的人群如女性、不吸煙、腺癌患者中，吉非替尼能提高無(wú)進(jìn)展生存期，提高生活質(zhì)量和生存率。但是對(duì)于腫瘤的治療需要多途徑多通路的同時(shí)綜合治療才會(huì)顯現(xiàn)較好的效果，對(duì)survivin基因抑制的靶向治療與其它途徑結(jié)合的治療是研究的熱點(diǎn)。有資料[13-14]顯示，通過(guò)siRNA干擾誘導(dǎo)切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC1)使survivin表達(dá)下調(diào)可以增加肺癌等腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的敏感性。Nakamura[15]等將野生型Survivin及其顯性失活突變體分別轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Survivin過(guò)表達(dá)可以使胃腺癌MKN45細(xì)胞逃避順鉑誘導(dǎo)的凋亡，而Survivin顯性失活突變體的表達(dá)則增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞株NUGC3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。各種方式對(duì)的survivin基因的干擾均對(duì)化療藥物治療起到了較好的輔助作用[16]。

我們通過(guò)小分子Survivin干擾RNA利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,并MTT法觀察吉非替尼對(duì)沉默Survivin后A549細(xì)胞的細(xì)胞的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin基因被沉默后，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少，腫瘤生長(zhǎng)停滯；吉非替尼對(duì)沉默Survivin后A549細(xì)胞的細(xì)胞的敏感性明顯增加。說(shuō)明沉默Survivin即可以直接有效降低細(xì)胞分裂增殖，也可以增加肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小分子Survivin干擾RNA沉默Survivin基因能夠增加肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可以成為治療或輔助治療肺癌的一個(gè)新方向。

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