陳靜 李晗△※ 張晨 王祖承 崔東紅△※

環(huán)境對轉(zhuǎn)基因小鼠抑郁樣行為的影響☆

陳靜*李晗*△※張晨*王祖承*崔東紅*△※

目的 探討環(huán)境因素對精神分裂癥斷裂基因1（disruptedinschizophrenia1，DISC1）轉(zhuǎn)基因小鼠抑郁樣行為的影響。方法C57BL/6野生型新生小鼠及C57BL/6 LBD-DISC1轉(zhuǎn)基因新生小鼠各16只，分別隨機分為野生實驗組、野生對照組和DISC1實驗組、DISC1對照組，每組8只。實驗組小鼠在哺乳期進行6 d母嬰分離，成年早期給予21 d慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激，采用糖水消耗實驗及強迫游泳實驗測定四組小鼠行為，并比較各組小鼠的體質(zhì)量改變。結(jié)果應(yīng)激和DISC1缺陷對小鼠糖水偏好度沒有交互作用（P＞0.05），DISC1實驗組糖水偏好度低于其余三組（均P＜0.01）；應(yīng)激和DISC1缺陷對小鼠強迫游泳實驗的靜止時間有交互作用（P=0.010），DISC1實驗組小鼠強迫游泳的靜止時間長于野生對照組和DISC1對照組（均P＜0.01）；應(yīng)激和DISC1缺陷對體質(zhì)量改變亦沒有交互作用（P＞0.05），但DISC1實驗組低于其余三組（均P＜0.01）。結(jié)論應(yīng)激和DISC1缺陷共同作用導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

母嬰分離 慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激 糖水消耗實驗 強迫游泳實驗 抑郁癥

【Key words】Maternal separation Chronic unpredictablemild stress The sucrose consumption The forced swim test Depression

目前已經(jīng)建立的抑郁癥動物模型有藥理學模型、基因操作模型、行為學模型、環(huán)境應(yīng)激模型等，這些均為單一因素建模。而近年來有研究者提出基因、環(huán)境雙重因素假設(shè)[1-2]，認為采用遺傳與環(huán)境應(yīng)激相結(jié)合的方式建立抑郁癥動物模型能更好地模擬抑郁癥的自然發(fā)病機制。精神分裂癥斷裂基因1（disruptedinschizophrenia1，DISC1）是近年發(fā)現(xiàn)的抑郁癥易感基因之一[3]。本研究基于以上理論基礎(chǔ)，以DISC1轉(zhuǎn)基因小鼠為載體，采用母嬰分離復(fù)合慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激方式，研究環(huán)境因素對DISC1轉(zhuǎn)基因小鼠抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物采用雄性C57BL/6野生型新生小鼠及C57BL/6 DISC1配體結(jié)合區(qū)域轉(zhuǎn)基因（C57BL/6 LBD-DISC1轉(zhuǎn)基因）新生小鼠各16只，分別隨機分為野生實驗組、野生對照組及DISC1實驗組、DISC1對照組，每組8只。C57BL/6野生型小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。C57BL/6 LBD-DISC1轉(zhuǎn)基因小鼠由李衛(wèi)東實驗室贈送，該轉(zhuǎn)基因小鼠為國際同行認可的基因工程小鼠模型之一，其轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可誘導(dǎo)。在沒有誘導(dǎo)劑（他莫昔芬Tamxiofen）時，DISC1轉(zhuǎn)基因融合蛋白雖可表達，但被熱休克蛋白包裹，而進入蛋白降解過程；當注射誘導(dǎo)劑時，短片段DISC1轉(zhuǎn)基因融合蛋白被解放，從而與野生型DISC1競爭目的蛋白的結(jié)合位點，破壞DISC1正常功能[4]。本研究在小鼠出生后第7天注射誘導(dǎo)劑他莫昔芬（Sigma，美國）制備LBD-DISC1轉(zhuǎn)基因小鼠。本實驗方案獲得上海市精神衛(wèi)生中心倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型構(gòu)建 將母鼠與新生小鼠置于室溫22±3℃（熱、冷應(yīng)激除外）、相對濕度55%～60%、12 h/12 h光/暗（燈亮時間為早5時至晚5時，通宵照明應(yīng)激除外）環(huán)境中飼養(yǎng)，允許自由進食、進水（禁食禁水應(yīng)激除外）。出生后7～12 d，對野生實驗組及DISC1實驗組進行為期6 d的母嬰分離，3 h/d。出生后70～90 d期間，對野生實驗組及DISC1實驗組進行為期21 d的慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激刺激，包括通宵照明（實驗室光源連續(xù)24 h開啟）、傾斜鼠籠（持續(xù)16 h將鼠籠傾斜45°）、夾尾（持續(xù)1 min）、搖晃（將小鼠放在240 r/min的搖床上5 min）、禁食禁水（持續(xù)24 h）、冰水游泳（將小鼠放置在4℃冰水中游泳5min）、潮濕墊料（墊料中傾倒150mL水，16 h后換墊料）。以上8種措施隨機采用，使小鼠無法預(yù)測。野生對照組和DISC1對照組只進行常規(guī)更換食水、墊料操作。

1.2.2 糖水消耗實驗 小鼠出生后91 d即成年后進行糖水消耗實驗。在經(jīng)過23 h的禁食禁水后，給予每只小鼠事先定量好的1瓶1%蔗糖水和1瓶純水。60min后，取瓶并稱質(zhì)量。計算總液體消耗量、糖水偏好度（糖水偏好度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%）。糖水偏好度是對獎勵的反應(yīng)，對應(yīng)抑郁癥的快感缺乏癥狀。

1.2.3 強迫游泳 小鼠出生后95 d即成年后進行強迫游泳實驗。將小鼠放入水深30 cm的圓柱形透明容器中使之游泳，起初小鼠掙扎試圖逃脫，很快變?yōu)椴粍訝顟B(tài)。實驗分為2天進行，第1天單只小鼠放入水中15 min，取出后在32℃溫室烘干，歸籠。24 h后再次實驗，記錄放入水中5min內(nèi)的累計不動狀態(tài)時間為靜止時間。強迫游泳中靜止時間反映小鼠的抑郁情緒。

1.2.4 體質(zhì)量 在小鼠出生后60 d及91 d時，測量每只小鼠的體質(zhì)量，并計算體質(zhì)量改變。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。糖水偏好指標、強迫游泳中靜止時間，以及體質(zhì)量變化中應(yīng)激和DISC1基因缺陷的作用采用兩因素方差分析法進行分析，采用LSD法進行兩兩比較。檢驗水準α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠糖水偏好度應(yīng)激（F=68.33，P＜0.01）與DISC1基因缺陷（F=43.30，P＜0.01）對小鼠糖水偏好度的主效應(yīng)均有統(tǒng)計學意義，但是兩者沒有交互作用（F=1.47，P=0.24）。對各組數(shù)據(jù)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，野生對照組小鼠的糖水偏好度高于其余三組（P＜0.01），野生實驗組與DISC1對照組小鼠的糖水偏好度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），DISC1實驗組小鼠的糖水偏好度低于野生實驗組和DISC1對照組（P＜0.01）。慢性應(yīng)激（F=0.27，P=0.61）、DISC1基因（F=0.10，P=0.75）對小鼠總液體消耗量的主效應(yīng)均無統(tǒng)計學意義，且兩者無交互作用（F= 0.33，P=0.57）。見表1。

2.2 小鼠強迫游泳中靜止時間應(yīng)激對小鼠強迫游泳實驗中靜止時間的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義（F= 171.87，P＜0.01），DISC1基因缺陷的主效應(yīng)沒有統(tǒng)計學意義（F=1.36，P=0.26），但是兩者之間有交互作用（F=8.57，P=0.01）。對各組數(shù)據(jù)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與野生對照組相比，野生實驗組和DISC1實驗組小鼠的靜止時間較長（P＜0.01），DISC1對照組小鼠的靜止時間較短（P＜0.05）；DISC1實驗組小鼠的靜止時間長于DISC1對照組（P＜0.01），但是與野生實驗組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 小鼠糖水消耗實驗與強迫游泳實驗結(jié)果（±s）

表1 小鼠糖水消耗實驗與強迫游泳實驗結(jié)果（±s）

1）與野生對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；2）與DISC1實驗組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；3）與DISC1對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01

強迫游泳靜止時間（s）167.80±5.721)141.20±8.473)172.40±2.191)3)130.50±3.87組別野生實驗組野生對照組DISC1實驗組DISC1對照組n8 8 8 8糖水偏好度0.47±0.131)2)0.78±0.093)0.13±0.071)3)0.55±0.04總液體消耗量（mL）3.32±0.86 3.35±0.93 3.45±1.20 2.87±1.64

表2 小鼠體質(zhì)量測量結(jié)果（±s）

表2 小鼠體質(zhì)量測量結(jié)果（±s）

1）與野生對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；2）與DISC1實驗組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；3）與DISC1對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01

組別野生實驗組野生對照組DISC1實驗組DISC1對照組n8 8 8 8出生后60 d（g）18.74±0.5020.76±0.7919.40±0.4920.44±0.62出生后91 d（g）22.14±0.8426.72±1.1320.44±0.5223.95±0.31體質(zhì)量改變（g）3.40±0.741)2)5.96±1.723)1.04±0.801)3)3.68±0.59

2.3 小鼠體質(zhì)量變化應(yīng)激（F=27.20，P＜0.01）與DISC1基因缺陷（F=21.743，P＜0.01）對小鼠體質(zhì)量改變的主效應(yīng)均有統(tǒng)計學意義，但是兩者沒有交互作用（F=0.01，P=0.94）。對各組數(shù)據(jù)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，野生對照組小鼠的體質(zhì)量改變高于其余三組（P＜0.01），DISC1實驗組小鼠的體質(zhì)量改變低于其余三組（P＜0.01）。見表2。

3 討論

目前認為抑郁癥是基因與環(huán)境相互作用導(dǎo)致的。DISC1基因是新近提出的抑郁癥易感基因之一[3]，多項研究顯示DISC1基因與抑郁癥相關(guān)[5]?；蜿P(guān)聯(lián)研究報道，DISC1基因SNP（Ser704Cys）的Cys704等位基因增高抑郁癥發(fā)病的危險度[6]?；谌巳旱难芯匡@示，DISC1變異與復(fù)發(fā)性抑郁癥的發(fā)病年齡等相關(guān)[7]。對DISC1基因突變小鼠的研究顯示，DISC1基因缺陷小鼠表現(xiàn)出社會快感缺乏等抑郁樣行為。本研究顯示出與之類似的結(jié)果，DISC1基因缺陷對小鼠糖水偏好度和體質(zhì)量改變的主效應(yīng)均有統(tǒng)計學意義，說明DISC1基因缺陷導(dǎo)致小鼠快感缺乏、體重較低。

在遺傳因素之外，抑郁癥也深受環(huán)境的影響，而應(yīng)激是最重要的環(huán)境因素。動物實驗顯示，早年生活應(yīng)激可通過下丘腦—垂體—腎上腺軸導(dǎo)致應(yīng)激引起的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)增強以及成年后的抑郁[8-10]。在早年應(yīng)激產(chǎn)生長期破壞性后果的基礎(chǔ)上，成年期生活事件導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)病。相關(guān)動物實驗顯示，慢性應(yīng)激影響嚙齒類動物的體重[11-12]；慢性不可預(yù)知應(yīng)激使小鼠在鼠尾懸吊實驗中的靜止時間增加[13]，廣泛用于制作抑郁癥動物模型[14]；慢性社會應(yīng)激導(dǎo)致社會回避、糖水消耗減少、強迫游泳的靜止時間增加等抑郁樣表現(xiàn)[15]。本研究對小鼠采用早年母嬰分離和成年期慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激相結(jié)合的方式模擬人類患者在整個生命歷程中的應(yīng)激模式，結(jié)果顯示，應(yīng)激組小鼠糖水偏好度更低，強迫游泳實驗的靜止時間更長，體質(zhì)量改變更少，表明應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠快感缺失、行為絕望、體重下降等抑郁樣表現(xiàn)。

以上結(jié)果表明，單一的DISC1缺陷或環(huán)境應(yīng)激就可以顯現(xiàn)出一些抑郁樣行為改變。但是目前有關(guān)環(huán)境因素對基因缺陷小鼠抑郁樣行為的影響的相關(guān)研究還較少，而環(huán)境誘因作用于基因缺陷對象導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的這一模式，更符合人類精神疾病的自然發(fā)病過程。本研究采用DISC1缺陷作為基因因素，早年母嬰分離與成年早期慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激相結(jié)合的復(fù)合慢性應(yīng)激作為環(huán)境因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境和DISC1基因缺陷對強迫游泳實驗的靜止時間有交互作用。這與已有的同類研究結(jié)果相一致[16]，如DISC1基因突變小鼠復(fù)合胎兒聚肌胞注射、朊蛋白啟動子調(diào)控的DISC1轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)合社會隔離的交互模型，均顯示出強迫游泳靜止時間延長的抑郁樣行為[17-18]。但是基因和應(yīng)激對糖水偏好度和體重的影響都沒有協(xié)同作用，這可能與小鼠的活動度、行為測試實驗的設(shè)計等有關(guān)。已有的多項研究也提示，基因或環(huán)境因素對不同的行為實驗產(chǎn)生不同的影響，而其中的具體機制還需要繼續(xù)研究。

綜上所述，環(huán)境因素作用于基因缺陷小鼠導(dǎo)致抑郁發(fā)生，相比環(huán)境或基因單一因素導(dǎo)致抑郁，這能更好地模擬人類自然發(fā)病過程，為更準確地研究抑郁癥的發(fā)病機制和治療提供了基礎(chǔ)。本研究僅采用反映抑郁癥核心癥狀的行為學實驗作為評價指標，在進一步的研究中，還需納入更多的行為學、生理學、藥理學評價指標，從多方面驗證本模型的信效度。

[1] Nabeshima T,Kim HC.Involvement of genetic and environmental factors in the onset of depression[J].ExpNeurobiol,2013,22 (4):235-243.

[2] Niwa M,Kamiya A,Murai R,et al.Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits[J]. Neuron，2010,65(4):480-489.

[3] Bradshaw NJ,Porteous DJ.DISC1-binding proteins in neural development,signalling and schizophrenia[J].Neuropharmacology,2012,62(3):1230-1241.

[4] LiW,Zhou Y,Jentsch JD，et al.Specific developmental disruption of disrupted-in-schizophrenia-1 function results in schizophrenia-related phenotypes in mice[J].PNAS,2007,104(46): 18280-18285.

[5] Knight HM,Pickard BS,Maclean A,et al.A cytogenetic abnormality and rare coding variantsidentify ABCA13 as a candidate gene in schizophrenia,bipolar disorder and depression[J].Am J Hum Genet,2009,85(6):833-846.

[6] Hashimoto R,Numakawa T,Ohnishi T,et al.Impact of the DISC1 Ser704Cys polymorphism on risk for major depression, brain morphology and ERK signaling[J].Human Molecular Genetics,2006,15(20):3024-3033.

[7] PA Thomson,DJ MacIntyre,G Hamilton,et al.Association of DISC1 variantswith age of onset in a population-based sample of recurrent major depression[J].Mol Psychiatry,2013,18(7): 745-747.

[8] Enthoven L,Oitzl MS,Koning N,et al.Hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity of newborn mice rapidly desensitizes to repeated maternal absence but becomes highly responsive to novelty[J].Endocrinology,2008,149(12):6366-6377.

[9] Nishi M,Horii-Hayashi N,Sasagawa T,et al.Effects of early life stress on brain activity:implications from maternal separation model in rodents[J].Gen Comp Endocrinol,2013,15(181): 306-309.

[10] 潘楠楠,王敏,馮海燕,等.早期母愛剝奪促發(fā)抑郁并增加癲癇易感性[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2013,39(7):406-410.

[11] Lee JK.Anti-depressant like effect of methyl gallate isolated from acerbarbinervein mice[J].Korean J Physiol Pharmacol, 2013,17(5):441-446.

[12] Schweizer MC,Henniger MS,Sillaber I.Chronic mild stress (CMS)in mice:of anhedonia,'anomalous anxiolysis'and activity [J].P Lo S One,2009,4(1):e4326.

[13] Yoon SH,Kim BH,Ye SK,et al.Chronic non-social stress affects depressive behaviors but not anxiety in mice[J].Korean J Physiol Pharmacol,2014,18(3):263-268.

[14] Hill MN,Hellemans KG,Verma P.Neurobiology of chronic mild stress:parallels tomajor depression[J].Neurosci Biobehav Rev,2012,36(9):2085-2117.

[15] Venzala E,García-García AL,ElizaldeN,et al.Chronic social defeat stress model:behavioral features,antidepressant action, and interaction with biological risk factors[J].Psychopharmacology(Berl),2012,224(2):313-325.

[16] Ibi D,Nagai T,Koike H,et al.Combined effect of neonatal immune activation and mutant DISC1 on phenotypic changes in adulthood[J].Behav Brain Res,2010,206(1):32-37.

[17] Abazyan B,Nomura J,Kannan G,et al.Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology[J].Biol Psychiatry,2010,68(12):1172-1181.

[18] Niwa M,Jaaro-Peled H,Tankou S,et al.Adolescent stress-induced epigenetic control of dopaminergic neurons via glucocorticoids[J].Science,2013,339(6117):335-339.

The influence of environment on depressive-like behavior of transgenic mice.

CHEN Jing,LI Han,ZHANG Chen,WANG Zucheng,CUI Donghong.
Shanghai Mental Health Center,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200030,China.Tel:021-64387250.

ObjectiveTo investigate the influence of environment on despressive-like behavior in DISC1 transgenic mice.MethodsSixteen C57BL/6 wild-typemice were random ly assigned into two groups,the WT-stress group and theWT-control group.Sixteen C57BL/6 LBD-DISC1 transgenicmicewere also randomly assigned into 2 groups,the DISC1-stress group and the DISC1-control group.TheWT-stress group and the DISC1-stress group received daily 3 h maternal separation for six consecutive days and chronic unpredictablemild stress for 21 consecutive days.The sucrose consumption and the forced swim testwere used to evaluate depressive-like behaviors.The changes of bodyweightwere measured.ResultsTherewas no interaction(P＞0.05)between environment and gene associated with the preference for sucrose solution.However,the preference for sucrose solution was lower in the DISC1-stress group than in the rest 3 groups(P＜0.01).Interaction between environment and gene associated with the immobility time was significant(P= 0.010)in the forced swim test.The immobility time was longer in the DISC1-stress group than in theWT-control group (P＜0.01).The bodyweightwas lower in the DISC1-stress group than in the rest3 groups(P＜0.01).But the interaction of environmentand gene associated with bodyweightwas not significant(P＞0.05).ConclusionThe interaction of gene and environment can induce depressive-like behavior inmice.

R749.4

A

2014-08-25）

（責任編輯：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.09.008

☆上海市科技發(fā)展基金實驗動物研究項目（編號：12140904200）；國家自然科學基金（編號：81171266；81271481）；上海市重性精神病重點實驗室（編號：13dz2260500）

*上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心（上海 200030）

△上海市重性精神病重點實驗室

※上海交通大學精神疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究重點實驗室