賀燕林，楊中林

(中國(guó)藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210009)

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陳皮不同提取物及橙皮苷部位的抗炎活性比較研究

賀燕林，楊中林*

(中國(guó)藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210009)

目的：比較研究陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性。方法：用1μg/mL的脂多糖(LPS)處理RAW264.7細(xì)胞，建立炎癥模型，采用NO試劑盒檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)模型細(xì)胞NO釋放量的影響；采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果及結(jié)論：陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位均具有顯著抗炎活性，且陳皮醇提物、陳皮水提物的抗炎活性優(yōu)于橙皮苷部位。

陳皮醇提物；陳皮水提物；橙皮苷部位；抗炎

陳皮(Pericarpium Citri Reticulatae)為蕓香科植物橘(CitursreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，主要含有黃酮、類(lèi)檸檬苦素、揮發(fā)油等化學(xué)成分。黃酮類(lèi)成分包括：橙皮苷、新陳皮苷、柑橘素等，其中橙皮苷為主要成分[1]?！吨袊?guó)藥典》記載陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰等作用，臨床主要用于胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[2]。目前對(duì)于陳皮抗炎作用的研究很少，本次實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型[3]，以模型細(xì)胞NO釋放量為指標(biāo)，比較研究陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用中藥陳皮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞(中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心惠贈(zèng))。

1.2 試藥與試劑

陳皮飲片(產(chǎn)地江蘇，購(gòu)自先聲藥店，經(jīng)本人鑒定為蕓香科植物橘CitursreticulataBlanco的干燥成熟果皮)；95%乙醇(分析純，南京鼎新化工輕工有限公司)；脂多糖(Sigma公司)；一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；二甲亞砜(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；四氮甲唑藍(lán)(南京化學(xué)試劑有限公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

0412-1型低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司)；BS124型電子天平(Sartorius Corporation，Germany)；超凈工作臺(tái)(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)；HERA Cell 150型恒溫培養(yǎng)箱(Kendro Laboratory Products，Germany)；RT-6000型酶標(biāo)分析儀(深圳書(shū)社生命科學(xué)股份有限公司)；HH-4型恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；COICXDS-1B型倒置光學(xué)顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；YXQ·SG41·280型電熱手提壓力蒸汽消毒器(上海醫(yī)用核子儀器廠)；79-1型磁力攪拌器(深圳國(guó)華儀器有限公司)；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Corstar Corporation，USA)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 陳皮醇提物、陳皮水提物、橙皮苷部位制備

2.1.1 陳皮醇提物制備 準(zhǔn)確稱取12.2g陳皮飲片置250mL圓底燒瓶中，溶媒為80%乙醇溶液，浸泡2h。共提取3次，第1次用10倍量溶媒提取2h，第2次用10倍量溶媒提取1h，第3次用10倍量溶媒提取1h，提取液8層紗布過(guò)濾后合并，減壓濃縮至無(wú)醇味，再將藥液置于水浴鍋上揮去水分(90℃)，真空干燥箱中干燥至衡重，得陳皮醇提物4.4g。陳皮醇提物得率=醇提物稱量/藥材稱量×100%=4.4g/12.2g×100%=36.1%。

2.1.2 陳皮水提物制備 準(zhǔn)確稱取12.2g陳皮飲片置250mL圓底燒瓶中，溶媒為水，浸泡2h。共提取3次，第1次用10倍量溶媒提取2h，第2次用10倍量溶媒提取1h，第3次用10倍量溶媒提取1h，提取液8層紗布過(guò)濾后合并，將藥液置于水浴鍋上揮去水分(90℃)，真空干燥箱中干燥至衡重，得陳皮水提物4.9g，陳皮水提物得率=水提物稱量/藥材稱量×100%=4.9g/12.2g×100%=40.1%。

2.1.3 橙皮苷部位制備 實(shí)驗(yàn)室前期采用醇提水沉等方法分離純化制備，藥材中該部位的得率為7%。經(jīng)HPLC法測(cè)定，該部位中陳皮苷含量為45.90%。

2.2 試藥配制

2.2.1 LPS造模劑溶液的配制 用十萬(wàn)分之一電子天平精密稱取LPS粉末1mg置于1.5mL離心管中，加入DMEM高糖培養(yǎng)基1mL，震蕩溶解。精密吸取0.1mL上述LPS溶液于15mL離心管中，加入9mL DMEM高糖培養(yǎng)基，混合均勻，得濃度為10μg/mL的LPS溶液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 陳皮醇提物溶液配制 用十萬(wàn)分之一電子天平精密稱取陳皮醇提物5.18mg(按醇提物得率換算，相當(dāng)于14mg生藥材)，40μL DMSO震蕩溶解，加入DMEM培養(yǎng)基0.96mL，混合均勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，得濃度為5 180μg/mL的陳皮醇提物溶液。依次對(duì)半稀釋，得濃度為2 590μg/mL、1 295μg/mL、647.5μg/mL的陳皮醇提物溶液，備用。

2.2.3 陳皮水提物溶液配制 用十萬(wàn)分之一電子天平精密稱取陳皮水提物2.81mg(按水提物得率換算，相當(dāng)于7mg生藥材)，20μL DMSO震蕩溶解，加入DMEM培養(yǎng)基0.98mL，混合均勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，得濃度為2 810μg/mL的陳皮水提物溶液，備用。

2.2.4 橙皮苷部位溶液的配制 用十萬(wàn)分之一電子天平精密稱取橙皮苷部位0.50mg(按橙皮苷部位得率換算，相當(dāng)于7mg生藥材)，20μL DMSO震蕩溶解，加入DMEM培養(yǎng)基0.98mL，混合均勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，得濃度為500μg/mL橙皮苷部位溶液，備用。

2.3 細(xì)胞給藥濃度確定

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 RAW264.7細(xì)胞在含有10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1鏈霉素的DEME高糖培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、飽和濕度空氣的培養(yǎng)箱37℃孵育，每2～3天傳代1次。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將RAW264.7細(xì)胞按60 000個(gè)/mL密度接種于96孔板中，隨機(jī)分為6組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔：①空白對(duì)照組：每孔加入200μL DMEM高糖培養(yǎng)基；②LPS模型組：每孔加入180μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液；③518μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的 LPS溶液、20μL 5180μg/mL的陳皮醇提物溶液；④259μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2590μg/mL的陳皮醇提物溶液；⑤129.5μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 1 295μg/mL的陳皮醇提物溶液；⑥64.75μg/mL的陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 647.5μg/mL的陳皮醇提物溶液。

2.3.2 NO釋放量測(cè)定 NO分泌量用NO試劑盒進(jìn)行測(cè)定。NO在生理溶液中不穩(wěn)定，大部分NO快速代謝成亞硝酸鹽NO2-和NO3-。本試劑盒采用硝酸還原酶特異性地將NO3-還原為NO2-，NO2-與顯色劑作用生成有色物質(zhì)，用比色法測(cè)定NO2-濃度即代表NO水平。

將加藥后的96孔板在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，用移液槍從每孔吸取100μL上清液，按NO試劑盒方法，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定培養(yǎng)板中各孔吸光度值。

2.3.3 細(xì)胞活力測(cè)定 細(xì)胞活力用MTT法進(jìn)行測(cè)定。將細(xì)胞以60 000個(gè)/mL密度接種于96孔板中，按照“2.3.1”項(xiàng)下的方法分組培養(yǎng)24h后，移除培養(yǎng)液，每孔加入180μL新鮮的培養(yǎng)基和20μL MTT 溶液(5g·L-1)，孵育4h后吸出上清，每孔加入200μL DMSO，輕輕振蕩10min，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。

2.4 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位抗炎活性比較

RAW264.7細(xì)胞在含有10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1鏈霉素的DEME高糖培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、飽和濕度空氣的培養(yǎng)箱37℃孵育，每2～3天傳代1次。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將RAW264.7細(xì)胞按60 000個(gè)/mL密度接種于96孔板中，隨機(jī)分為6組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。①空白對(duì)照組：每孔加入200μL DMEM高糖培養(yǎng)基；②LPS模型組：每孔加入180μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液；③陳皮水提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2810μg/mL的陳皮水提物溶液；④陳皮醇提物組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 2 590μg/mL的陳皮醇提物溶液；⑤橙皮苷部位組：每孔加入160μL DMEM高糖培養(yǎng)基、20μL 10μg/mL的LPS溶液、20μL 500μg/mL的橙皮苷部位溶液。

將加藥后的96孔板在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，參照“2.3.2”項(xiàng)、“2.3.3”項(xiàng)下方法，測(cè)定模型細(xì)胞NO的釋放量及細(xì)胞活力。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 細(xì)胞給藥濃度確定

NO分泌量用NO試劑盒進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，造模組NO值明顯升高，且與空白組作t檢驗(yàn)的P值<0.01，說(shuō)明造模成功。518μg/mL、259μg/mL陳皮醇提物組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗(yàn)的P值<0.01，說(shuō)明518μg/mL、259μg/mL的陳皮醇提物具有極顯著抗炎活性。129.5μg/mL陳皮醇提物給藥組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗(yàn)的P值<0.05，說(shuō)明129.5μg/mL的陳皮醇提物具有顯著抗炎活性。64.75μg/mL的陳皮醇提物組NO值略有降低，與造模組作t檢驗(yàn)的P值>0.05，說(shuō)明64.75μg/mL的陳皮醇提物無(wú)明顯的抗炎活性。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的陳皮醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

細(xì)胞活力用MTT法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，518μg/mL陳皮醇提物組細(xì)胞存活率降低，且與空白組作t檢驗(yàn)的P值<0.05，說(shuō)明518μg/mL陳皮醇提物具有一定的細(xì)胞毒性。259μg/mL、129.5μg/mL、64.75μg/mL的陳皮醇提物組與空白對(duì)照組比較，P值>0.05，說(shuō)明上述3個(gè)濃度的陳皮醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度的陳皮醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

注：與空白組比較，#P<0.05。

小結(jié)：以抗炎活性和對(duì)細(xì)胞活力的影響為指標(biāo)，將抗炎活性比較研究中陳皮醇提物的細(xì)胞給藥濃度確定為259μg/mL。

3.2 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

NO分泌量用NO試劑盒進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，造模組NO值明顯升高，且與空白組作t檢驗(yàn)的P值<0.01，說(shuō)明造模成功。各給藥組與模型組比較，陳皮水提物給藥組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗(yàn)的P值<0.01，說(shuō)明281μg/mL的陳皮水提物具有極顯著抗炎活性。陳皮醇提物給藥組NO值明顯降低，且與造模組作t檢驗(yàn)的P值<0.01，說(shuō)明259μg/mL的陳皮醇提物具有極顯著抗炎活性。橙皮苷部位給藥組NO值有一定的降低，且與造模組作t檢驗(yàn)的P值<0.05，說(shuō)明50μg/mL的橙皮苷部位具有顯著性抗炎活性，具體結(jié)果見(jiàn)表3。NO抑制率=(模型組OD值-測(cè)定組OD值)/模型組OD值。

表3 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

3.3 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞活力用MTT法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，模型組、各

給藥組與空白對(duì)照組比較，P>0.05，說(shuō)明各個(gè)給藥組對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力均無(wú)明顯影響，具體結(jié)果見(jiàn)表4。存活率=給藥組OD值/空白組OD值×100%。

表4 陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

4 討論

研究表明[4]，巨噬細(xì)胞受到外界刺激極易被激活引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥介質(zhì)或致炎物可誘導(dǎo)或增加局部NO的合成和釋放。本研究以LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，以模型細(xì)胞NO釋放量和細(xì)胞活力為指標(biāo)，比較研究陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位的抗炎活性，方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠。

很多慢性疾病的發(fā)病機(jī)制都涉及炎癥。因此，抗炎治療成為預(yù)防和治療各種疾病的重要途徑[5-6]。本次研究表明，陳皮醇提物、陳皮水提物及橙皮苷部位均可顯著降低模型細(xì)胞NO的釋放量，具有顯著抗炎活性。且通過(guò)各給藥組組間比較可知，陳皮醇提物、陳皮水提物的抗炎活性優(yōu)于橙皮苷部位，推測(cè)為陳皮提取物中多成分協(xié)同作用的結(jié)果。

[1] 鄭小吉，詹曉如，王小平．陳皮研究進(jìn)展[J]．中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9(10)：30-32．

[2] 王春燕．淺談陳皮的藥理作用及臨床應(yīng)用[J]．中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2013，11(3)：120-131．

[3] 李曉紅，齊云，蔡潤(rùn)蘭，等．蘆薈大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO生成及iNOS表達(dá)的影響[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(4)：488-492．

[4] Li LP, Zhang JX, Li LF, et al. Effect of an inoguanidine on pulmonary apoptosis in the lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J].Chin Phamacol Bull,2007,23(1):28-32.

[5] L JUNG T,LUNDBERG S,VARSANYI M,et al.Rectal nitric oxide as biomarker in the treatment of inflammatory bowel disease responders versus nonresponders[J].World J Gastroenterol,2006,12(21):3386-3392.

[6] LALA PK,CHAKRABORTY C.Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression[J].Lancet Oncol,2001,2(3):149-156.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-03-10

賀燕林(1989-)，女，中國(guó)藥科大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。

楊中林(1950-)，女，中國(guó)藥科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。E-mail:yzl1950@126.com。

R284.2

A

1673-2197(2014)13-0023-03