趙國(guó)忠，王夢(mèng)穎，韓俊燕，趙建新，張 灝，陳 衛(wèi)*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

東北酸菜因其鮮咸酸爽、脆嫩可口、開胃解膩，并能幫助消化等優(yōu)點(diǎn)，成為盛行于東北的一種腌制菜品[1]。酸菜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有纖維素、礦物質(zhì)及人體代謝不可缺少的有機(jī)化合物，如乳酸、膽堿、乙酰膽堿、維生素C、維生素B12等，其不僅風(fēng)味獨(dú)特，而且具有調(diào)節(jié)血液平衡、調(diào)節(jié)膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等生理功效[2]。東北地區(qū)冬季氣候寒冷，腌制貯存大白菜可延長(zhǎng)其保藏期，在酸菜腌制過(guò)程中，發(fā)酵液中的微生物起了關(guān)鍵的作用，它們可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸，促進(jìn)酸菜獨(dú)特風(fēng)味及其特殊生理功能的形成。

近年來(lái)，岳喜慶等[3-4]對(duì)東北酸菜的質(zhì)地變化、感官品質(zhì)、各種理化指標(biāo)及風(fēng)味變化研究較為突出，并且確定了自然發(fā)酵酸菜的5種主體風(fēng)味成分：二甲基二硫、二甲基三硫、（E，Z）-2,6-壬二烯醛、乙醛和2-戊基呋喃。SUZZI G等[5]對(duì)酸菜中的有害物質(zhì)如生物胺有深入的研究。但還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于東北酸菜菌株微生態(tài)與感官質(zhì)量、理化特性之間的聯(lián)系的相關(guān)研究，二者之間的相關(guān)聯(lián)系尚不明確。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同緯度東北三省多個(gè)地區(qū)的酸菜進(jìn)行樣品采集、感官評(píng)定，探討其感官品質(zhì)與其理化指標(biāo)之間的關(guān)系，尋找其中的相互聯(lián)系，并分析其原因。此外對(duì)感官得分高的酸菜樣品中的優(yōu)良菌株進(jìn)行分離篩選，以期從天然發(fā)酵酸菜產(chǎn)品中尋找優(yōu)質(zhì)菌種資源，為實(shí)現(xiàn)優(yōu)良菌株微生態(tài)的有效利用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北酸菜：從東北三省的普通家庭腌制酸菜中隨機(jī)采集24份成熟酸菜樣品，樣品具體來(lái)源及對(duì)應(yīng)編號(hào)見表1。

表1 24份東北酸菜樣品的來(lái)源與編號(hào)Table 1 24 parts of the sources and numbers of Northeast sauerkraut samples

分析所用試劑均為市售分析純；有機(jī)酸檢測(cè)所用試劑為市售色譜純；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）參考文獻(xiàn)[6-7]配制。

1.2 儀器與設(shè)備

FE-20精密pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-S12恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；1525型高效液相色譜儀：美國(guó)沃特斯公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái)：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；SP-250生化培養(yǎng)箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；DM 2000熒光顯微鏡：徠卡儀器（德國(guó)）有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀：美國(guó)伯樂BIO-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸菜樣品感官評(píng)定方法

取出一定量酸菜樣品放置于潔凈瓷盤中，組織一個(gè)由20位專業(yè)感官評(píng)定人員組成的感官評(píng)定小組，分別從色澤、氣味、滋味、質(zhì)地等4個(gè)方面對(duì)酸菜樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)定采用打分制，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，共13個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目，總分為130分。

1.3.2 理化指標(biāo)檢測(cè)方法

酸菜樣品中各種理化指標(biāo)的測(cè)定方法如下：總酸的測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；還原糖的測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》；亞硝酸鹽的測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺法，參考國(guó)標(biāo)GB/T 5009.33—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硝酸鹽與亞硝酸鹽的測(cè)定》；有機(jī)酸測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)GB/T 5009.157—2003《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》。

酸菜樣品中氨基酸種類及含量的測(cè)定送至江南大學(xué)檢測(cè)中心進(jìn)行。

表2 酸菜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of sauerkraut

1.3.3 菌株篩選及鑒定

菌株篩選方法[8]：將不同酸菜樣品汁液分別用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6這6個(gè)稀釋度的菌液在MRS平板上進(jìn)行涂布，然后在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，觀察長(zhǎng)出的單菌落，挑取不同形態(tài)、大小的菌落進(jìn)行劃線純化，三次分離純化之后，對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并確定菌株形態(tài)，將鏡檢后的菌株接種于MRS液體管中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后于MRS斜面培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，最后于4 ℃冰箱保存，備用。

菌株鑒定方法：采用16S rDNA序列分析法對(duì)篩選到乳酸菌進(jìn)行序列分析，確定其種屬。將活化好的菌液，參考文獻(xiàn)[9]中的基因組提取方法，對(duì)菌株的全基因組DNA進(jìn)行提取，對(duì)得到的基因組DNA的16S rDNA區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，選擇細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物27F序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物1492R序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增片段分別為1 500 bp。PCR體系50 μL：10×buffer 5 μL；三磷酸脫氧核糖核苷（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）5μL；上游引物（25μmol/L）0.5 μL；下游引物（25 μmol/L）0.5 μL；TaqDNA聚合酶（250 U）0.5 μL；模板DNA 1.5 μL；ddH2O 37 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min；72 ℃、5 min，2～4步進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度及濃度，將達(dá)到測(cè)序要求的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上用Blast進(jìn)行比對(duì)，并確定其種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北不同地區(qū)酸菜的感官評(píng)定

對(duì)采自東北三省不同地區(qū)的24個(gè)酸菜樣品進(jìn)行感官分析，評(píng)價(jià)采用打分制，分?jǐn)?shù)越高則樣品感官質(zhì)量越好、接受度越高，對(duì)每個(gè)酸菜樣品的得分結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均總得分，其中總分為130分，感官評(píng)價(jià)得分見表3。

表3 樣品感官得分Table 3 Sensory scores of samples

由表3可知，感官得分最高的3個(gè)樣品分別為來(lái)自遼寧省的L-6、L-5及吉林省的G-5，這三個(gè)樣品無(wú)論從色澤、滋味、質(zhì)地上都優(yōu)于其他樣品，感官評(píng)定得分最低的樣品分別為來(lái)自黑龍江延壽的H-2、吉林省G-11及黑龍江省的H-4，相對(duì)其他樣品而言，它們的綜合感官質(zhì)量比較低。

整體分析感官數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，遼寧省的樣品中75%樣品的感官得分高于平均分，其比例在3個(gè)省份中最高，而黑龍江省的酸菜樣品的感官得分總體較低，吉林省樣品居中，說(shuō)明樣品的感官質(zhì)量在省份之間差異較大，整體而言，遼寧省酸菜樣品感官質(zhì)量最高。

2.2 總酸含量結(jié)果分析

酸菜在發(fā)酵過(guò)程中，微生物經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)和無(wú)氧呼吸會(huì)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸等各種有機(jī)酸，酸的產(chǎn)生不僅可以改善酸菜的風(fēng)味，而且能有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)[10-11]，現(xiàn)采用酸堿滴定法對(duì)酸菜樣品中的總酸含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖1。

由圖1可知，不同地區(qū)的酸菜樣品總酸含量差異較大，其中感官評(píng)定得分最高的L-6具有較高的酸度，達(dá)到0.18 mol/L。整體分析，遼寧省所有樣品的總酸含量均高于平均值，而吉林省酸菜樣品總酸含量高于樣品平均值的比例僅為36.36%，這與各省的整體感官質(zhì)量變化趨勢(shì)相符合。同時(shí)，觀察數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，感官質(zhì)量比較低的樣品H-2、H-4、G-11的總酸值均低于平均值。由上述分析可知，樣品總酸含量與感官質(zhì)量之間具有相同的變化趨勢(shì)，總酸含量高的產(chǎn)品感官得分較高。分析出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)檫|寧省所處緯度較其他三省要低，冬季溫度略高于其他省，在酸菜發(fā)酵過(guò)程中有益微生物的量最多，從而發(fā)酵產(chǎn)生更多的酸。

圖1 不同東北酸菜樣品中總酸含量Fig.1 Total acid content in different Northeast sauerkrauts

2.3 還原糖含量結(jié)果分析

對(duì)酸菜樣品中的還原糖含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 不同東北酸菜樣品中還原糖的含量Fig.2 Reducing sugar content in different Northeast sauerkrauts

由圖2可知，吉林省樣品G-4的還原糖含量最高，其次是G-5，還原糖含量最低的樣品為G-2，吉林省樣品中還原糖含量高于平均值的樣品比例達(dá)到72.72%，分析比較數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)還原糖的含量與感官品質(zhì)沒有明顯的聯(lián)系。

2.4 氨基酸結(jié)果分析

氨基酸是酸菜樣品中主要的香味、風(fēng)味來(lái)源，發(fā)酵蔬菜中含有的氨基酸的鮮味遠(yuǎn)超過(guò)單純的谷氨酸鈉的鮮味[12]。分別對(duì)感官得分較高和較低的2組樣品進(jìn)行氨基酸種類和含量的測(cè)定，其氨基酸總量測(cè)定結(jié)果見圖3，L-6樣品中具體氨基酸種類和含量見表4。

圖3 四組酸菜樣品中氨基酸的含量Fig.3 Amino acid content in four kinds of Northeast sauerkrauts

由圖3可知，樣品之間氨基酸含量存在較大差異，其中感官得分最高的樣品L-6的氨基酸含量最高，達(dá)到2 212 mg/L，其次是G-11、H-2，分別達(dá)到1 398 mg/L和1 179 mg/L，氨基酸含量最低的樣品為L(zhǎng)-5，含量為842 mg/L。由此得出，感官得分高的酸菜樣品氨基酸含量較高，微生物可能在氨基酸代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

表4 L-6樣品中氨基酸種類和含量Table 4 Types and contents of amino acids in L-6 sample

由表4可知，L-6樣品中含有17種游離氨基酸，其中丙氨酸含量最高，達(dá)到629.46 mg/L，占總氨基酸量的28.46%，半胱氨酸含量最低，為1.05 mg/L，僅占樣品氨基酸總量的0.05%，此外，樣品中含有除了色氨酸以外的其他7種人體必需氨基酸，總量達(dá)到422.89mg/L，占總氨基酸含量的30.25%，杜書等[13]對(duì)自然發(fā)酵酸菜中游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，同樣也發(fā)現(xiàn)其中含有7種人體必需氨基酸。以上數(shù)據(jù)表明，酸菜具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.5 亞硝酸鹽結(jié)果分析

傳統(tǒng)酸菜采用鹽漬、發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，蔬菜中的硝酸鹽易被發(fā)酵過(guò)程中的微生物轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，而它是一種致癌物前體，長(zhǎng)期大量食用會(huì)對(duì)身體健康造成威脅[14-15]。采用鹽酸萘乙二胺法[16]對(duì)24個(gè)酸菜樣品中亞硝酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4 不同東北酸菜樣品中亞硝酸鹽含量Fig.4 Nitrite content in different Northeast sauerkrauts

由圖4可知，感官得分、酸度較高的酸菜樣品L-5、L-6的亞硝酸鹽含量很低，幾乎為零，而感官得分、酸度較低的樣品H-4，亞硝酸鹽含量較高，達(dá)到7.5 mg/kg。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，黑龍江省的所有酸菜樣品的亞硝酸鹽含量均高于24組樣品平均值，而其感官得分在三個(gè)省中也最低，酸度也偏低。由此可推測(cè)在感官質(zhì)量、酸度和亞硝酸鹽含量三者之間存在重要的相互關(guān)系，即酸菜樣品的感官質(zhì)量與酸度呈正比，與亞硝酸鹽含量呈反比。推測(cè)感官得分較高的酸菜發(fā)酵過(guò)程中有益菌含量高，產(chǎn)酸量大，進(jìn)而腐敗菌生長(zhǎng)較少，亞硝酸鹽含量低。

2.6 發(fā)酵微生物菌株的分離鑒定

酸菜發(fā)酵過(guò)程中微生物群系起了重要的作用，其中乳酸菌占主導(dǎo)地位[17-19]，對(duì)感官得分較高的酸菜樣品中的乳酸菌進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)分離得到8株乳酸菌，對(duì)其16S rDNA片段擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序，在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)分析對(duì)應(yīng)的序列，比對(duì)結(jié)果見表5。

表5 菌株序列比對(duì)結(jié)果Table 5 Sequence results of strains

由表5可知，在篩選出的8株細(xì)菌中有6株植物乳桿菌、1株鼠李糖乳桿菌和1株布氏乳桿菌，這三種乳桿菌均能夠發(fā)酵白菜中的糖分產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，其中，植物乳桿菌為主導(dǎo)發(fā)酵菌株，在發(fā)酵體系中豐度較大，能夠快速產(chǎn)生乳酸及其他風(fēng)味物質(zhì)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同緯度的酸菜樣品感官質(zhì)量差異較大，緯度較高省市的酸菜感官質(zhì)量低于緯度低地區(qū)。緯度越高的地區(qū)冬季氣溫越低，在過(guò)低的溫度時(shí)，微生物活性較低、生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵體系中有益發(fā)酵菌株含量較低，不利于有機(jī)酸及其他風(fēng)味物質(zhì)的形成，也更易產(chǎn)生各種腐敗菌，導(dǎo)致亞硝酸鹽含量增加。酸菜樣品的感官質(zhì)量與其酸度、氨基酸、亞硝酸鹽含量等理化特性有密切的聯(lián)系，感官質(zhì)量越高的樣品其酸度、氨基酸含量相對(duì)越高，亞硝酸鹽的含量相對(duì)越低，其在發(fā)酵過(guò)程中可能有較大的乳酸菌豐度，如植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌均能發(fā)酵產(chǎn)酸、醛、酯類物質(zhì)，經(jīng)過(guò)其發(fā)酵的蔬菜，不僅碳水化合物和蛋白質(zhì)類物質(zhì)得到進(jìn)一步分解，利于人體消化吸收，而且其酸類物質(zhì)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物進(jìn)而會(huì)抑制生產(chǎn)亞硝酸鹽的腐敗菌的生長(zhǎng)。

從酸菜樣品中成功篩選出能發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸及其他風(fēng)味物質(zhì)的植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、布氏乳桿菌，對(duì)酸菜發(fā)酵過(guò)程中存在的微生物菌系有了一定的了解，有助于后期優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)酸菜發(fā)酵菌種的篩選，為中國(guó)發(fā)酵酸菜的工業(yè)化奠定良好的基礎(chǔ)。

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