羿麗杰，姜 宇，詹佳碩，閔鐘熳*

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.環(huán)境保護(hù)部核與輻射安全中心，北京 100082）

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，食品安全已成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點(diǎn)。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌對(duì)人類健康造成極大危害，乳酸菌代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素因具有抑菌、天然、安全的特性，而成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前食品中使用的細(xì)菌素多為Ⅰ類細(xì)菌素，但是大多數(shù)乳酸菌菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素抑菌譜較窄，且通常對(duì)引起食品腐敗的革蘭氏陰性菌不具有抑制作用，產(chǎn)生的量較少，且有些細(xì)菌素由質(zhì)粒編碼，產(chǎn)量不穩(wěn)定，理化性質(zhì)也不是很好。而本實(shí)驗(yàn)所要研究的腸球菌素E3是屬于Ⅱ類乳酸菌細(xì)菌素，對(duì)大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和米曲霉具有抑制作用，而且它耐高溫，具有熱穩(wěn)定性[1]，因此是最有希望成為天然食品防腐劑的新型食品添加劑。

本試驗(yàn)以東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離出的一株產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌菌株BC-3為研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)生腸球菌素E3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[2]，并對(duì)腸球菌素E3的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌：屎腸球菌（Enterococcus faecium）BC-3 分離自北方傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基[4]采用MRS培養(yǎng)基，溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ型超凈工作臺(tái)：上海愛(ài)明儀器有限公司；pH計(jì)：Thermo（MODEL868）美國(guó)科峻儀器公司；YXQ型電熱高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；DHP-781恒溫培養(yǎng)箱：日本愛(ài)朗；Kendor離心機(jī)：美國(guó)科峻儀器公司；HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抑菌效果測(cè)定

采用濾紙片法[5-6]，測(cè)量抑菌直徑，取3次試驗(yàn)的平均值。其中抑菌圈直徑包括濾紙直徑（6 mm）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)[7-8]

發(fā)酵時(shí)間的影響：保持試驗(yàn)過(guò)程中其他條件不變，發(fā)酵的時(shí)間為16 h、20 h、24 h、28 h，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

溫度的影響：保持試驗(yàn)過(guò)程中其他條件不變，溫度為35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃，培養(yǎng)20 h，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

pH值的影響：保持試驗(yàn)過(guò)程中其他條件不變，pH值為5、6、7、8，培養(yǎng)20 h，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

接種量的影響：保持試驗(yàn)過(guò)程中其他條件不變，接種量為1%、2%、3%、4%，培養(yǎng)20 h，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.3 正交試驗(yàn)選擇初發(fā)酵最佳的條件

為了進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵條件，取4個(gè)影響因素：發(fā)酵時(shí)間、pH、接種量、溫度分別為A、B、C、D，各3個(gè)水平，制定因素水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

1.3.4 腸球菌素生物學(xué)性質(zhì)的研究

（1）硫酸銨鹽析[9-10]

屎腸球菌BC-3發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min、4 ℃低溫離心10 min，取上清液棄菌體沉淀。取上清液用硫酸銨粉末進(jìn)行鹽析，鹽析液裝于截留分子質(zhì)量為3 500 ku的透析袋中對(duì)去離子水透析脫鹽，用BaCl2跟蹤檢測(cè)去離子水中的硫酸根離子，沒(méi)有白色沉淀出現(xiàn)則透析完畢。透析后用液體用PEG20000濃縮至透析前體積，存放于4 ℃冰箱中待用。

（2）溫度對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

分別取等量的腸球菌素E3于EP管中，在60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃條件下水浴加熱10 min、20 min，然后測(cè)定其對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響。

（3）pH值對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

取等量的腸球菌素E3于EP管中，分別調(diào)pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，測(cè)定其對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響。

（4）蛋白酶對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

取等量的腸球菌素E3于5個(gè)EP管中，然后分別向試管中加入等量胃蛋白酶、胰蛋白酶，木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，空白，然后觀察抑菌活性。

（5）有機(jī)溶劑對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

取等量的腸球菌素E3于EP管中，分別加入乙醇、丙酮、乙醚、異丙醇，同體積原液為對(duì)照，測(cè)量抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on enterococcin E3 yield

由圖1可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性影響較大，腸球菌素E3產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而先增后降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為20 h時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大，抑菌圈直徑為16.34 mm。

2.1.2 溫度的影響

不同的溫度對(duì)屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的影響見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of temperature on enterococcin E3 yield

由圖2可知，溫度對(duì)抑菌活性影響較大，腸球菌素E3產(chǎn)量隨溫度升高而先增后降，在溫度為37 ℃時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大，抑菌圈直徑達(dá)到最大為16.33 mm。

2.1.3 pH值的影響

不同的pH值對(duì)屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on enterococcin E3 yield

由圖3可知，腸球菌素E3產(chǎn)量隨pH的變化不是很明顯，隨pH增加抑菌活性先增后降，當(dāng)pH值為6時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大，此時(shí)抑菌圈直徑為16.24 mm。

2.1.4 接種量的影響

不同的接種量對(duì)屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的影響見(jiàn)圖4。

圖4 接種量對(duì)腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inoculum on enterococcin E3 yield

由圖4可知，腸球菌素E3產(chǎn)量隨接種量的增加而先增后降，當(dāng)接種量為2%時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大，此時(shí)抑菌圈的直徑為16.66 mm。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定，最佳溫度為37 ℃，最佳pH值為6，最佳接種量為2%，最佳發(fā)酵時(shí)間為20 h，為了進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵條件的組合，取4種影響因素：發(fā)酵時(shí)間、pH值、接種量、溫度，各因素取3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)極差分析表明，各因素的主次影響順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間＞溫度＞pH＞接種量，這表明發(fā)酵時(shí)間對(duì)屎腸球菌產(chǎn)腸球菌素E3量的影響最大，確定了屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的最佳發(fā)酵條件組合為A2B3C1D2。即在發(fā)酵時(shí)間為20 h、pH值為6.5、接種量為1.5%、溫度為37.0 ℃時(shí)抑菌效果最強(qiáng)，在此條件下的抑菌圈直徑為17.87 mm。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

2.3 腸球菌素的生物學(xué)特性

2.3.1 溫度和時(shí)間對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素E3粗提液，對(duì)其在不同溫度下的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，研究溫度和時(shí)間對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 溫度和時(shí)間對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of temperature and time on enterococcin E3 stability

由表3可知，道腸球菌素E3熱穩(wěn)定性較高，在120 ℃水浴加熱處理15 min后，抑菌活性仍能達(dá)到90%左右。

2.3.2 pH值對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素粗提液，對(duì)其在不同pH值下的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，研究pH值對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 pH對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH on enterococcin E3 stability

由表4可知，腸球菌素E3在pH值2.0～10.0的范圍內(nèi)仍具有抑菌活性，且抑菌活性的變化不是很大，這說(shuō)明pH值對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有影響。

2.3.3 蛋白酶對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素E3粗提液，對(duì)其在經(jīng)不同蛋白酶處理下的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，研究蛋白酶對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 蛋白酶對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of protease on enterococcin E3 stability

由表5可知，腸球菌素E3經(jīng)各蛋白酶的作用，能夠完全失活，可確定這種抑菌活性的物質(zhì)為蛋白質(zhì)[11]，而且可被蛋白酶降解不會(huì)在機(jī)體內(nèi)殘留，具有較高的安全性[12]，這與岳喜慶等[13]曾經(jīng)的報(bào)道相似。

2.3.4 有機(jī)溶劑對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素E3粗提液，對(duì)其在不同有機(jī)溶劑處理下的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，研究有機(jī)溶劑對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 有機(jī)溶劑對(duì)腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of organic solvents on enterococcin E3 stability

由表6可知，腸球菌素E3經(jīng)有機(jī)溶劑作用后仍具有抑菌活性，因此有機(jī)溶劑作用對(duì)腸球菌素E3的影響不是很大，證明其化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

為提高腸球菌素E3的產(chǎn)量，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到在發(fā)酵時(shí)間為20 h、pH值為6.5、接種量為1.5%、溫度為37.0 ℃時(shí)抑菌活性最高，此時(shí)抑菌直徑為17.87 mm。對(duì)腸球菌素E3的生物學(xué)特性試驗(yàn)分析得到，腸球菌素E3具有耐熱性，在pH為2.0～10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，可以被蛋白酶完全降解，安全性高，有機(jī)溶液處理后其穩(wěn)定性幾乎不受影響。說(shuō)明腸球菌素E3在食品防腐中具有很好的應(yīng)用前景[14-15]，值得進(jìn)一步深入研究。

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