王雅楠，孔衛(wèi)平，孫冬霞

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖道常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位。CDK4作為一種細胞周期正向調(diào)節(jié)因子已被證實是一種癌基因，在許多實驗性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［1］。本研究采用免疫組化染色SP法檢測正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中CDK4和ki67蛋白的表達情況，并分析CDK4和ki67在子宮內(nèi)膜癌中的表達情況與生物學行為的關系，以期為臨床診斷、病情監(jiān)測和預后評估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年2月—2013年5月邯鄲市中醫(yī)院和邯鄲市婦幼保健院婦科收治的子宮內(nèi)膜癌患者60例，年齡45～67歲，平均53.1歲。癌組織的病理分期:Ⅰ期15例，Ⅱ期24例，Ⅲ期12例，Ⅳ期9例;組織學分級:G1級36例，G2級13例，G3級11例。侵犯及浸潤深度:局限于黏膜層及浸潤≤1/2肌層44例，浸潤＞1/2肌層16例。所有患者留取標本前未行放、化療及激素治療。另外選取同期子宮肌瘤或子宮脫垂而手術切除子宮的正常子宮內(nèi)膜標本 (均為分泌期子宮內(nèi)膜)32例，年齡46～67歲，平均51.6歲。

1.2 儀器與試劑 儀器:切片機 (德國LAIKA)、光學顯微鏡 (日本OLYMPUS)、恒溫烤箱 (中國山東濰坊)、電熱恒溫培養(yǎng)箱 (余姚市遠東數(shù)控儀廠)、自動漂片儀 (中國安徽電子科學研究院)等。試劑:SP試劑盒、二硝基聯(lián)苯胺 (DAB)顯色液及CDK4多克隆抗體 (購自博士德公司)，ki67檢測試劑盒 (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 方法 采用免疫組化染色SP法檢測CDK4和ki67的表達情況，陽性對照為乳腺癌組織切片，陰性對照以PBS緩沖液代替一抗，操作步驟嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

1.4 結果判定 CDK4及ki67陽性染色均定位于腫瘤細胞核，在細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性標準采用Parenti等［1］的計數(shù)標準，具體方法:每張切片隨機選5個高倍視野(×400)進行計數(shù)，陽性細胞數(shù)＜5%為 (－)，5% ～25%為(+)，26% ～50%為 (++)，＞50%為 (+++)。－為陰性表達，+～+++為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗;CDK4與 ki67陽性表達的關系采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CDK4和ki67在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達情況 子宮內(nèi)膜癌組織中CDK4和ki67表達定位于細胞核，其在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達率分別為78.3%(47/60)、85.0%(51/60);CDK4和ki67在正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達率分別為25.0%(8/32)和12.5%(4/32)。CDK4和ki67在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達率高于正常子宮內(nèi)膜組織(P ＜0.05)。

2.2 CDK4和ki67在子宮內(nèi)膜癌中的表達與臨床病理特征的關系 在組織學分級G2～G3級、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的患者中CDK4和ki67的陽性表達率分別高于組織學分級G1級、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者 (P＜0.05);子宮內(nèi)膜癌患者不同浸潤深度及病理類型間CDK4和ki67的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 子宮內(nèi)膜癌患者CDK4和ki67的表達與臨床病理特征的關系Table1 Relationship of the expression of CDK4 and ki67 in endometrial carcinoma with clinicopathologic factor

2.3 CDK4和ki67在子宮內(nèi)膜癌組織中的相關性 在子宮內(nèi)膜癌組織中CDK4與ki67的表達呈正相關 (r=0.459，P＜0.05)。

3 討論

腫瘤可以認為是一類細胞周期病。細胞周期是一高度有序的分子事件，各時相嚴格按照G1－S－G2－M的順序進行。CDK是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (cyclin－depend－entkinases，CDKs)家族的成員之一，CDK4基因定位于12q13染色體，含有3個外顯子及2個內(nèi)含子，人類CDK4是由34個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是細胞周期G1期的正調(diào)控因子［2］。作用機制為CDK4通過Cyclin D激活與之形成復合物，Rb蛋白發(fā)生磷酸化，釋放轉錄因子E2F，E2F使得幾個重要的DNA合成基因發(fā)生轉錄，使DNA合成得以進行，細胞由G1期進入S期，從而使細胞分裂、增殖，在細胞周期起到了正調(diào)節(jié)作用，CDK4是一種癌基因，相關報道證實在黑色素瘤［3］、大腸癌［4］、宮頸癌［5］、胃癌［6］等中 CDK4 的基因擴增和蛋白表達失調(diào)。本研究結果顯示，CDK4蛋白結果顯示其陽性表達主要位于細胞核內(nèi)，CDK4的核表達可能有助于細胞的增殖過程，在子宮內(nèi)膜癌組織中呈過度表達，在正常子宮內(nèi)膜組織中低表達，表明在子宮內(nèi)膜癌中CDK4的過度表達對腫瘤的發(fā)生起到了促進作用;CDK4的過度表達與子宮內(nèi)膜癌的病理分期、組織學分級、淋巴結轉移有關，表明CDK4的過度表達在一定程度上可以反映子宮內(nèi)膜癌的生物學特性，對子宮內(nèi)膜癌的病程進展、腫瘤分化、發(fā)展起到促進作用，說明其表達水平越高、腫瘤的侵襲力越強、惡性度就越高?？傊梢哉J為CDK4過度表達可加速細胞增殖，促進腫瘤細胞異常增生、浸潤和腫瘤復發(fā)而導致預后不良。

ki67是一種與細胞增殖密切相關的大分子蛋白，分布于細胞核內(nèi)，屬于IgG家族，是目前臨床上廣泛應用的檢測細胞增殖的標志，是可靠而迅速地反映惡性腫瘤增殖率的指標，其高表達是細胞增殖活躍的重要標志。ki67在除了G0期之外的所有細胞周期中均有表達，在G1后期開始出現(xiàn)，S期、G2期升高，M期達高峰，其后迅速降解，ki67主要分布于增生性的或高轉化性的組織中，而在一些被認為是非增生性的或低轉化性的組織中，ki67幾乎不表達，說明ki67與細胞的合成代謝有關，其表達的高低反映了細胞增殖的程度。近年來ki67單克隆抗體已廣泛應用于研究腫瘤和非腫瘤組織細胞增生活性，有研究表明，其與惡性腫瘤的發(fā)展、轉移和預后高度相關，ki67與腫瘤惡性程度關系基本一致，隨著惡性程度的發(fā)展而增高。ki67抗原表達情況主要反映惡性腫瘤細胞的增殖活性，有關資料證實其與惡性腫瘤的發(fā)展、轉移和預后高度相關［7］。另外相關學者研究發(fā)現(xiàn)ki67的表達情況能夠體現(xiàn)出惡性腫瘤細胞分化低、增殖快的特點，可以認為ki67高表達是腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期事件［8－9］。本研究結果顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中ki67陽性表達主要定位于細胞核，呈過度表達，明顯高于正常內(nèi)膜組織，ki67與子宮內(nèi)膜癌的病理分期、組織學分級、淋巴結轉移有關。因此，子宮內(nèi)膜癌中ki67的高表達可提示腫瘤細胞增殖活躍、侵襲性強、易發(fā)生轉移、預后不良。綜上所述，ki67能客觀反映子宮內(nèi)膜癌的增殖活性，可以作為評價子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展和預后的重要指標之一。

同時，筆者對CDK4和ki67在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)CDK4和ki67的表達在子宮內(nèi)膜癌中呈正相關，CDK4是細胞周期G1期的正調(diào)控因子，ki67在細胞周期G1期開始發(fā)揮作用，兩者在細胞增殖方面應該存在聯(lián)系，這種聯(lián)系會促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、進展，兩者的監(jiān)測工作對子宮內(nèi)膜癌診斷治療、評價預后有重要參考價值，可以作為評價子宮內(nèi)膜癌生物學行為的重要指標之一。聯(lián)合檢測CDK4和ki67在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達情況有助于指導臨床治療，為子宮內(nèi)膜癌防治探索新思路。

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