王永彬，劉鳳美，張軍令，李艷華，靳淑敏，丁靜靜

(開封市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，河南 開封475000)

對精原干細胞(spermatogonial stem cell，SSCs) 的生理生化特性及其分裂增殖、分化、運動、衰老、死亡等各項生命活動的調(diào)節(jié)機制的深入研究，精子發(fā)生機理的進一步闡明以及精原干細胞異體、異種移植技術(shù)的實際應(yīng)用，都迫切需要找到一種可行的方法將其分離純化，以期得到較高產(chǎn)量和純度的有活力的精原干細胞，用于體外培養(yǎng)。

在小鼠睪丸中，大約1 萬個睪丸生殖細胞中才有2 ～3 個精原干細胞［1］，它的數(shù)量稀少妨礙了對其進一步的深入研究。因此，獲取大量高純度的精原干細胞對研究其生物學特征并進行有效操作是非常必要的。隨著出生后時間的增長，精原干細胞逐步分化形成各級生精細胞，其數(shù)量及所占比例都會越來越少，這樣使得SSCs 的分離純化極為困難，故選擇動物的出生天數(shù)應(yīng)較小。一般小鼠選用出生后7 ～8 d，大鼠選用出生后9 ～10 d 的為宜。

本研究旨在探索獲得足夠數(shù)量和純度的小鼠精原細胞的方法，為精原干細胞的體外培養(yǎng)和移植提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

出生6 ～8 d 的昆明白小鼠。

1.2 主要試劑

膠原酶(C-5138，美國Sigma 公司) 、胰蛋白酶(T0303- 1G，Sigma- Aldrich 公司) 、臺盼藍(Trypan Blue，T6146-5G，美國Sigma 公司) 、Percoll(P- 1644，美國Sigma 公司) 、DMEM(12800058，美國Gibco公司) 、無Ca2+、Mg2+的PBS，其余藥品為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(NUAIRE) 、低速離心機(HETTICH MIKRO-22) 、二氧化碳培養(yǎng)箱(THERMO) 、一次性無菌培養(yǎng)皿、實體顯微鏡、恒溫水浴鍋、手術(shù)剪刀、鑷子、細胞篩、血球計數(shù)板。

1.4 取樣

將5 只6 ～8日齡昆明白小鼠頸椎脫臼處死，然后用碘酒和酒精消毒腹部，沿腹正中線切口，在兩側(cè)腹股溝處找到并無菌取出睪丸，置于盛有無Ca2+、Mg2+PBS 的塑料平皿中備用。

1.5 Percoll 梯度溶液的制備

先用1.5 mol/L 的NaCl 將Percoll 液稀釋為90% 的Percoll 母液，然后用PBS 作為Percoll 稀釋液將母液稀釋到表1 各密度梯度。

表1 Percoll 密度梯度的濃度、組成及密度

1.6 細胞懸液的制備

在實體鏡下去除睪丸周圍脂肪組織、附睪及白膜，收集松散的曲細精管，移入盛有適量無Ca2+、Mg2+PBS 的5 mL 離心管中，待曲細精管完全沉淀后棄上清。加入相當于組織10 倍體積的含1 mg/mL Ⅳ型膠原酶的DMEM 后放入培養(yǎng)箱，37 ℃消化15 min，每5 min 輕搖1 次。棄上清后再用PBS 清洗兩次，然后再向離心管中加入含1.5 mg/mLⅠ型透明質(zhì)酸酶和含0.25 mg/mL 胰蛋白酶的DMEM，放入培養(yǎng)箱消化10 min。200 目細胞篩(74 μm) 過濾兩次，600 ×g 離心5 min，棄上清，加入2 mL 的DMEM 混勻，制成單細胞懸液。用移液器取出1 滴制備好的細胞懸液，加入1 滴0.4%臺盼藍混勻，在3 min內(nèi)倒置相差顯微鏡下用血球計數(shù)板分別計算活細胞、死細胞、細胞團的數(shù)目和細胞總數(shù)，鏡下觀察時死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。

1.7 Percoll 梯度的制備及離心分離

用帶長針頭的注射器從已制備好的每級Percoll 密度梯度液中各取1 mL，按密度從大到小依次分層疊加到15 mL 離心管中。用吸管吸取2 mL 待分離的細胞懸液，大約含8 ×106個細胞，小心加在15 mL 離心管中梯度液頂層的分離介質(zhì)上面。將離心管放置4 h或以1 400 r/min(800 g) 離心30 min 使細胞分層。

1.8 細胞收獲及計數(shù)

用帶長針頭的注射器將各梯度中形成的細胞帶小心吸取出，移至事先標記好的5 mL離心管中，各加入2 mL PBS 稀釋，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，重新加入2 mL的DMEM 培養(yǎng)液，并輕輕吹打均勻。取出1 滴制備好的細胞懸液，加入1 滴0.4%臺盼藍混勻，在3 min 內(nèi)倒置相差顯微鏡下用血球計數(shù)板分別計算活細胞、死細胞、細胞團的數(shù)目和細胞總數(shù)，鏡下觀察死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。細胞收獲量為每個睪丸獲得的細胞總數(shù)，用每次實驗獲得的細胞總數(shù)除以該次實驗所用睪丸個數(shù)即可。

圖1 Percoll 密度梯度法純化精原干細胞流程圖

1.9 差異貼壁和堿性磷酸酶染色

經(jīng)Percoll 梯度離心分離的精原細胞中混有支持細胞，將此細胞懸液接種在含10%FBS 的DMEM 無菌培養(yǎng)皿中，置CO2培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度條件下，培養(yǎng)約12 h，待細胞貼壁后進行堿性磷酸酶(AKP) 染色，倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 小鼠睪丸細胞消化效果

本實驗對6 ～8日齡乳鼠睪丸共進行了4次分離，分離后獲得了小鼠睪丸組織單細胞懸液。4 次實驗所獲懸液量均為2.0 mL。平均每個睪丸可獲得4.53 ×105個細胞，其中死細胞、活細胞、細胞團平均所占百分比依次為2.97%、97.03%、2.95%(表2) 。

表2 兩步酶消化的效果

2.2 Percoll 密度梯度初步純化結(jié)果

經(jīng)Percoll 密度梯度離心，細胞主要在相鄰梯度的界面處形成細胞帶。分布在20% ～30% Percoll 梯度間的主要是細胞間質(zhì)、細胞碎片及少量死細胞，記為1 帶; 分布在30%～40%Percoll 梯度間的細胞較少，平均密度為3.64×105個/mL，記為2 帶; 分布在40%～50%Percoll 梯度間的細胞最多，平均密度達3.20×106個/mL，記為3 帶; 分布在50%～60%Percoll 梯度間的細胞也較少，平均密度為3.86×105個/mL，記為4 帶(表3) 。

表3 細胞在Percoll 密度梯度中的分布

2.3 精原干細胞的初步鑒定

3 帶中的細胞培養(yǎng)12 h 進行AKP 染色，精原干細胞呈陽性或強陽性，被染成深褐色，支持細胞和精原細胞呈陰性，不著色。通過染色后獲得的照片對陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計計數(shù)，精原干細胞的純度平均為6.47%。

3 討論

本實驗選取6 ～8日齡乳鼠睪丸，兩步酶消化法分離獲得了含有SSCs 的細胞懸液。這一時期分離到的細胞懸液除了含有精原細胞和支持細胞外，其它雜細胞較少。平均每個睪丸可獲4.53 ×105個細胞，和張學明等［2］的研究結(jié)果相似。

目前，研究者們已經(jīng)采取多種方法并結(jié)合隱睪模型、維生素A 缺乏動物模型、基因突變小鼠等來分離和純化精原干細胞，將精原干細胞的純度大大提高了。如單位重力沉降法、牛血清白蛋白梯度和單位重力速度沉降法等。利用免疫熒光激活細胞分選術(shù)能分離出大量有活性的精原干細胞［3］; 根據(jù)細胞表面標記結(jié)合隱睪模型，應(yīng)用流式細胞儀進行免疫熒光激活的多參數(shù)篩選，并將篩選的精原細胞移植到受體小鼠的睪丸，以移植細胞的克隆數(shù)作為評估指標，證實可以將精原干細胞純化152 ～166 倍［4］; 運用磁性細胞分類技術(shù)能快速有效地分離出倉鼠、小鼠以及猴的精原細胞［5］; 通過Percoll 不連續(xù)密度梯度法能分離出純度達65% ～87%的A 型精原細胞［6］。

Percoll 是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，滲透壓低，對細胞無毒，惰性，與生物膜不發(fā)生粘附。用它制成的梯度在室溫下放置數(shù)星期而梯度的形狀不發(fā)生變化。Percoll 密度梯度離心已被許多學者用來分離各種動物的精子，用來分離精原干細胞也有很多報道。本實驗結(jié)果表明，小鼠精原細胞主要分布在40% ～50%Percoll 梯度間，和已有的報道結(jié)果相似。

本試驗對3 帶中的細胞進行堿性磷酸酶(AKP) 染色，有被染成深褐色的陽性細胞，這些細胞具有干細胞特性，是精原干細胞，占3 帶中細胞總量的6.47%。該帶細胞接種后，根據(jù)精原細胞與支持細胞貼壁速度快慢的不同，利用差異貼壁法，可將其進一步純化。

本實驗根據(jù)細胞分離理論，結(jié)合實踐經(jīng)驗，對昆明白小鼠睪丸生殖細胞進行了體外分離和初步培養(yǎng)鑒定。結(jié)果表明，該實驗方法能夠分離出較高生物學活性的精原細胞，并可以為精原干細胞移植和深入研究精子發(fā)生機理提供研究材料和技術(shù)支持。

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