周振華，李 焱，黃 權(quán)，王旭東，徐樂勤，陳 素，肖建如

骨巨細(xì)胞瘤(giant cell tumor of bone，GCTB)是常見的原發(fā)骨腫瘤之一，好發(fā)于青壯年。盡管該腫瘤轉(zhuǎn)移少見，但是其具有侵襲性和潛在惡性，局部刮除術(shù)后復(fù)發(fā)率為20%～70%，約5%的病例可發(fā)生肉瘤樣惡變［1］。世界衛(wèi)生組織將其定義為良惡性交界的骨腫瘤。GCTB影像學(xué)表現(xiàn)較為典型［2］，診斷并不存在困難，但化療對(duì)及放療的效果并不滿意，放射治療GCTB甚至可導(dǎo)致發(fā)病部位繼發(fā)肉瘤，因此對(duì)于GCTB的患者應(yīng)慎重選擇化療與放療，臨床上多采用手術(shù)進(jìn)行治療［3］。盡管早在2個(gè)世紀(jì)前已有學(xué)者描述此瘤的一些臨床特點(diǎn)，但是至今有關(guān)此瘤的相關(guān)基礎(chǔ)研究相比其它腫瘤仍非常少見，對(duì)其發(fā)生機(jī)制、生物學(xué)行為進(jìn)行探索具有深遠(yuǎn)的意義。

近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)［4］的提出為腫瘤研究提供了新的思路。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體，均具有自我更新能力和不定向分化潛能，并可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。現(xiàn)認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤形成及其不斷生長(zhǎng)的根源。目前在結(jié)腸癌［5-6］、肝癌［7-9］、乳腺癌［10-13］等實(shí)體瘤中腫瘤干細(xì)胞相繼被發(fā)現(xiàn)分離，推動(dòng)了腫瘤研究的進(jìn)展。盡管越來(lái)越多的實(shí)體瘤干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)分離，但是這些實(shí)體瘤幾乎都是惡性實(shí)體瘤，關(guān)于良性或良惡性交界性腫瘤干細(xì)胞分離鑒定的研究鮮見報(bào)道。GCTB屬于良惡性交接性的原發(fā)骨腫瘤，其生物學(xué)特性不同于單純的良惡性腫瘤，此外，該腫瘤組成成分復(fù)雜，其腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制也不十分明了，這些都給GCTB的研究帶來(lái)了難度。在本研究中，臨床標(biāo)本原代培養(yǎng)獲取的GCTB細(xì)胞培養(yǎng)出了GCTB球體，并對(duì)該球體細(xì)胞進(jìn)行了初步的功能學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該球體細(xì)胞群具有干細(xì)胞樣特征，為將來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行研究和臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，Serotec公司)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF，Serotec公司)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1，Serotec公司)，RNA提取試劑Trizol(Gibco公司)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(TAKARA公司)，PCR引物(Invitrogen公司)，Transwell(BD公司)

1.2 原代培養(yǎng)和GCTB細(xì)胞系的建立

用于原代培養(yǎng)的手術(shù)標(biāo)本來(lái)源于1位45歲的男性患者，該患者被診斷為C4椎體GCTB并在該院進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)。手術(shù)切除后的無(wú)菌新鮮標(biāo)本一部分送往病理科進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)為GCTB，另一部分標(biāo)本裝入盛有Hank液的50 mL無(wú)菌離心管中立即送往細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行后續(xù)的處置工作。在細(xì)胞超凈工作臺(tái)中將離心管中的標(biāo)本倒入10 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用Hank液反復(fù)沖洗，去除標(biāo)本表面粘附的紅細(xì)胞，用無(wú)菌組織剪將組織塊反復(fù)剪切至糜狀，將組織移入裝有10 mL DMEM培養(yǎng)基的50 mL無(wú)菌離心管中，加入Ⅱ型膠原酶10 μL，同時(shí)加入青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 mg/mL)，放入恒溫振蕩儀中在37℃的條件下以每分鐘200次的速度進(jìn)行振蕩，2 h取出后用巴氏吸管將其吹打混勻，將組織懸液用400目(約37 μm)無(wú)菌金屬篩網(wǎng)中過篩，收集過篩后的液體，用巴氏吸管緊貼離心管沿其壁緩慢加入到預(yù)盛5 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的15 mL無(wú)菌離心管中，放入離心機(jī)中2500 r/min水平離心30 min。離心完畢后取出，將中間的細(xì)胞層小心用吸管吸出置入另一離心管中，5 mL磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)對(duì)其吹打、重懸，再次離心，去上清后底部即為分離所得的組織細(xì)胞。將經(jīng)過上述處理獲得的細(xì)胞接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有20%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素 (100 mg/mL)的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在溫度設(shè)定為37℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天用倒置相差顯微鏡定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，第3天進(jìn)行半量換液1次。第5天進(jìn)行全量換液1次。第7天用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶將貼壁細(xì)胞消化后進(jìn)行1∶2傳代。將傳代后的細(xì)胞接種于新的25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的過程中，挑選不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行凍存保種，收集細(xì)胞后將細(xì)胞用凍存液(90%胎牛血清，10%二甲基亞砜)重懸，將凍存管放入液氮罐中保存。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代細(xì)胞按3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL含10%胎牛血清的DMEM，置5%CO2、飽和濕度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每天加入20 μL CCK-8(Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)試劑，37℃孵育2 h，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)吸收值，連續(xù)檢測(cè)5 d。

1.4GCTB細(xì)胞球體誘導(dǎo)

將3×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GCTB細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM-F12培養(yǎng)基中(Gibco公司)，培養(yǎng)基中含青霉素100 U/mL，鏈霉素50 μg/mL，細(xì)胞置于超低吸附培養(yǎng)皿中(Corning)培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加EGF(20 ng/mL)bFGF(20 ng/mL)，IGF(20 ng/mL)，于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔1天添加1次生長(zhǎng)因子，待5～7 d GCTB球體細(xì)胞體積較大時(shí)吸取培養(yǎng)基離心，用DMEM-F12培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶3比例傳代。

1.5 核心轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)(RAN抽提，RT-PCR)

①總RNA抽提:用無(wú)菌PBS清洗待測(cè)球體細(xì)胞2次;吸干殘液后，加1 mL Trizol裂解細(xì)胞;向細(xì)胞裂解液中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩后，室溫下靜置10 min;4℃，12000 r/min，離心15 min;吸出含RNA的上層水相，移至另一離心管;加入與水等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10 min;4℃，12000 r/min，離心10 min，令RNA沉淀;棄上清液，加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水配制的 75% 乙醇 1mL，洗滌 RNA;4℃ ，7500 r/min，離心8 min，棄上清液;RNA沉淀在空氣中干燥10 min，用40 μL DEPC水溶解;紫外分光光度儀測(cè)定濃度。②RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA:將RNA稀釋到100 ng/μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5×PrimeScript?RT Master Mix(TAKARA)2 μL，RNA 5 μL，RNase Free dH2O 3 μL。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1∶40 稀釋后備用。③real time PCR:反應(yīng)體系為:2×PreMix(TAKARA)5 μL;Primers(Pairs)1 μL;Rox 0.2 μL;cDNA 3.8 μL。擴(kuò)增條件:預(yù)變性 95℃15 s;95℃ 5 s，60℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)中使用的引物為Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)(見表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell、24孔培養(yǎng)板、Matrigel置于4℃ 冰箱過夜，將Transwell置于24孔板中，Matrigel和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按1∶5比例混合，取60 μL加入Transwell上室，37℃溫育2 h以使其凝固。將GCTB原代細(xì)胞和球體細(xì)胞用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，與上室中加入200 μL細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)，下室中加入800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每室設(shè)3個(gè)對(duì)照;于37℃、5%CO2的條件中培養(yǎng)24 h，取出上室，用結(jié)晶紫染色，用棉簽擦除未能侵襲的細(xì)胞，于200倍光鏡下，隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞進(jìn)行比較。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

裸鼠用1%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)麻醉，仰臥位，膠帶固定前肢及左后肢，使右后肢屈曲，脛股骨夾角成45°，然后手持1 mL TB針筒29 G針頭刺入脛股骨關(guān)節(jié)間隙，從脛骨頭關(guān)節(jié)窩凹點(diǎn)處進(jìn)針，順著脛骨骨干長(zhǎng)軸方向緩慢鉆透脛骨頭松質(zhì)骨部分進(jìn)入骨髓腔，有明顯的突破感。旋轉(zhuǎn)緩慢進(jìn)入擴(kuò)髓，退出針頭后沿原進(jìn)針點(diǎn)用微量進(jìn)樣器插入骨髓腔，緩緩注入用Matrigel膠與DMEM1∶1配制的GCTB球體細(xì)胞懸液20 μL，約5×105個(gè)細(xì)胞，最后拔出針頭。待裸鼠蘇醒后回籠。對(duì)側(cè)注射同體積Matrigel膠與DMEM含1×106GCTB親代細(xì)胞作為對(duì)照。后每周定期用動(dòng)物X線機(jī)(Kodak，DXS4000 Pro system)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。

2 結(jié) 果

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞懸液接種24 h后，開始可以觀察到貼壁細(xì)胞，這些細(xì)胞大小、形態(tài)不一，主要可以看到形態(tài)巨大的多核巨細(xì)胞和梭形的基質(zhì)細(xì)胞，其中多核細(xì)胞細(xì)胞核排列緊密，梭形細(xì)胞大小不一，形態(tài)多樣，核體積增大，核漿比例失調(diào)。經(jīng)過連續(xù)3次傳代以后，多核巨細(xì)胞基本在視野中消失，只能觀測(cè)到梭形的基質(zhì)細(xì)胞(見圖1)。連續(xù)5 d檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，得到原代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(見圖2)。

圖1 原代細(xì)胞(×100)Fig.1 Primary cell(×100)

圖2 生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve

2.2 細(xì)胞球體形成

腫瘤干細(xì)胞在無(wú)血清特殊培養(yǎng)條件下具有形成球體的能力，因此培養(yǎng)球體細(xì)胞可以成為富集干細(xì)胞的手段之一。將GCTB細(xì)胞培養(yǎng)在含有生長(zhǎng)因子的DMEM/F12培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)5 d后GCTB細(xì)胞形成了球體(見圖3)。

2.3 干細(xì)胞相關(guān)核心轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)

在原代GCTB細(xì)胞和培養(yǎng)的球體細(xì)胞中同時(shí)用real-time PCR檢測(cè)了干細(xì)胞自我更新相關(guān)的基因OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原代細(xì)胞相比，GCTB球體細(xì)胞中OCT4、Sox2和NANOG的mRNA表達(dá)都是明顯上調(diào)的(見圖4)，特別是OCT4，其在球體細(xì)胞中mRNA的含量是原代細(xì)胞中含量的49倍。這些結(jié)果表明培養(yǎng)形成的球體細(xì)胞具有一定的干細(xì)胞特性。

圖3 球體形成(×200)Fig.3 Development of sphere(×200)

圖4 干細(xì)胞相關(guān)核心轉(zhuǎn)錄因子real-time PCR檢測(cè)Fig.4 Real-Time PCR for the detection of“stemness”-associated core transcription factors

2.4 侵襲實(shí)驗(yàn)

通過transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GCTB球體細(xì)胞的侵襲性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCTB球體細(xì)胞的侵襲性明顯強(qiáng)于GCTB原代細(xì)胞(見圖5)，2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖5 侵襲實(shí)驗(yàn)Fig.5 Invasion sssay

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行GCTB細(xì)胞骨腔注射后4周后對(duì)小鼠進(jìn)行了X線檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中骨近端出現(xiàn)骨質(zhì)破壞(見圖6箭頭所指位置)，而對(duì)照組骨質(zhì)密度連續(xù)均一，皮質(zhì)完整，提示GCTB球體細(xì)胞在骨環(huán)境中比GCTB親代細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力。

圖5 GCTB細(xì)胞注射4周后小鼠脛骨X線檢測(cè)結(jié)果Fig.5 X-ray films 4 weeks after GCTB cells transplant

3 討 論

目前的腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)研究多聚焦于惡性腫瘤，很少有良性腫瘤干細(xì)胞的研究報(bào)道。其原因在于良性腫瘤的危害性要小于惡性腫瘤，良性腫瘤或交界性腫瘤的相關(guān)研究不像惡性腫瘤研究那樣深入，那么良性腫瘤中是否存在腫瘤干細(xì)胞?筆者認(rèn)為如果說(shuō)腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞的話，那么不管是良性腫瘤還是惡性腫瘤都應(yīng)該存在腫瘤干細(xì)胞。另外，就腫瘤的異質(zhì)性這個(gè)特點(diǎn)來(lái)講，不同類型的腫瘤細(xì)胞成瘤能力也就會(huì)存在差異，那么也必然會(huì)有某一類群細(xì)胞成瘤能力最強(qiáng)。所以這一亞群就也可以被稱為腫瘤干細(xì)胞，但是由于良性腫瘤同惡性腫瘤生物學(xué)特性方面有很大差異，比如說(shuō)極少出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，而惡性腫瘤中目前有很多研究認(rèn)為是某個(gè)亞群的腫瘤干細(xì)胞決定了是否轉(zhuǎn)移，如果良性腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞，為何轉(zhuǎn)移極為罕見?這些都是需要漫長(zhǎng)的探索研究才能解決的問題。本研究?jī)H是對(duì)GCTB干細(xì)胞進(jìn)行了初探。

腫瘤干細(xì)胞研究的首要問題就是分離鑒定，但是由于缺乏特異的標(biāo)志物，腫瘤干細(xì)胞的分離純化一直是各國(guó)科學(xué)家亟待解決的難題之一。到目前為止已經(jīng)報(bào)道了很多腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，例如CD133是一個(gè)報(bào)道很多的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，在多種實(shí)體瘤干細(xì)胞中都有報(bào)道［14-18］。也有學(xué)者用分選側(cè)群細(xì)胞的方法來(lái)得到腫瘤干細(xì)胞。側(cè)群細(xì)胞最初用來(lái)從鼠骨髓中分選造血干細(xì)胞［19］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系［20］、肝癌［21］和卵巢癌［22］中也發(fā)現(xiàn)有側(cè)群細(xì)胞。

與上面的用標(biāo)志物法來(lái)分離鑒定腫瘤干細(xì)胞的方法相比，球體培養(yǎng)是更簡(jiǎn)單易行的方法。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞能夠懸浮生長(zhǎng)或在半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而普通細(xì)胞不附著于固體表面就不能生長(zhǎng)。這可能是由干細(xì)胞非附著性生長(zhǎng)的特性決定的，其確切的機(jī)制目前尚不明確。腫瘤干細(xì)胞也具有這種特性。在腦腫瘤與乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中的CD133+ 細(xì)胞［15］與乳腺癌中的 CD44+、CD24-細(xì)胞［11］均可在無(wú)血清培養(yǎng)基形成細(xì)胞球及在軟瓊脂中形成克隆，這是鑒定其是否具有自我更新能力的重要步驟，也是腦腫瘤及乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)重要特性。本實(shí)驗(yàn)利用了這個(gè)特性富集干細(xì)胞，所培養(yǎng)的GCTB球體細(xì)胞中OCT4、SOX2和NANOG的mRNA水平與原代細(xì)胞相比都是明顯上調(diào)的。OCT4、SOX2和NANOG是調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性的三個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子，能維持胚胎干細(xì)胞正常的未分化狀態(tài)并促進(jìn)其增殖，而親代細(xì)胞株這三種蛋白表達(dá)很低［23-24］。本研究中培養(yǎng)的GCTB球體細(xì)胞中OCT4、SOX2和NANOG明顯上調(diào)，說(shuō)明球體細(xì)胞是具有一定干細(xì)胞特性的。

腫瘤干細(xì)胞的來(lái)源一直是有爭(zhēng)議的問題，GCTB的組成成分復(fù)雜，除了多核巨細(xì)胞外，基質(zhì)細(xì)胞有2種，一種為成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞;另一種為巨噬細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞在原代培養(yǎng)中可占10% ～40%，經(jīng)傳代后逐漸減少，最后只剩下梭形排列的成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞。至于基質(zhì)細(xì)胞的起源，有學(xué)者認(rèn)為對(duì)腫瘤性質(zhì)起決定作用的成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞來(lái)自于骨髓的原始間葉組織，而巨噬細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞系單核巨噬系統(tǒng)來(lái)源，代表機(jī)體的免疫反應(yīng)。本研究中用到的都是來(lái)源于亞洲GCTB患者的GCTB細(xì)胞系，所有的手術(shù)標(biāo)本在原代培養(yǎng)早期可以看到細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中仍然保持與病理切片一致的形態(tài)，即以多核巨細(xì)胞為中心，周圍圍繞基質(zhì)細(xì)胞，但在傳代后，多核巨細(xì)胞逐漸消失，視野中只能看見梭形的基質(zhì)細(xì)胞，以1×108此種基質(zhì)細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠進(jìn)行注射已經(jīng)可以致瘤，對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮無(wú)血清培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)成球，后來(lái)的球體細(xì)胞正是來(lái)源于此。這證明GCTB對(duì)腫瘤的致瘤能力和侵襲能力起重要作用的是基質(zhì)細(xì)胞。值得注意的是以單一形態(tài)的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行小鼠致瘤的標(biāo)本，取出后進(jìn)行切片可以再次看見GCTB的典型病理形態(tài)。說(shuō)明多核巨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)缺乏體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的調(diào)控而消失或者可能是裂變成單核的基質(zhì)細(xì)胞，而重新注入免疫小鼠體內(nèi)后，基質(zhì)細(xì)胞再次分裂或多個(gè)細(xì)胞聚合形成多核巨細(xì)胞，說(shuō)明基質(zhì)細(xì)胞在GCTB的發(fā)生發(fā)展中起著主導(dǎo)作用，其發(fā)生機(jī)制還需用示蹤學(xué)的相關(guān)方法或手段進(jìn)一步研究。

［1］ Gitelis S，Mallin BA，Piasecki P，et al.Intralesional excision compared with en bloc resection for giant-cell tumors of bone［J］.J Bone Joint Surg Am，1993，75(11):1648-1655.

［2］ 蔡崇輝，陳一安，蘇奇.脊柱骨巨細(xì)胞瘤的CT與MRI診斷［J］.脊柱外科雜志，2005，3(6):338-340.

［3］ 杜開利，黃東生，彭焰，等.脊柱原發(fā)性腫瘤的切除方式與療效分析［J］.脊柱外科雜志，2008，6(4):206-209.

［4］ Clarke MF，Dick JE，Dirks PB，et al.Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions:AACR Workshop on cancer stem cells［J］.Cancer Res，2006，66(19):9339-9344.

［5］ Ricci-Vitiani L，Lombardi DG，Pilozzi E，et al.Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells［J］.Nature，2007，445(7123):111-115.

［6］ Dalerba P，Dylla SJ，Park IK，et al.Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(24):10158-10163.

［7］ Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13(2):153-166.

［8］ Lee TK，Castilho A，Cheung VC，et al.CD24(+)liver tumorinitiating cells drive self-renewal and tumor initiation through STAT3-mediated NANOG regulation［J］.Cell Stem Cell，2011，9(1):50-63.

［9］ Yin S，Li J，Hu C，et al.CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity［J］.Int J Cancer，2007，120(7):1444-1450.

［10］ Wright MH，Calcagno AM，Salcido CD，et al.Brca1 breast tumors contain distinct CD44+/CD24-and CD133+cells with cancer stem cell characteristics［J］.Breast Cancer Res.2008;10(1):R10.

［11］ Gudjonsson T，Villadsen R，Nielsen HL，et al.Isolation，immortalization，and characterization of a human breast epithelial cell line with stem cell properties［J］.Genes Dev，2002，16(6):693-706.

［12］ Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(7):3983-8398.

［13］ Ponti D，Costa A，Zaffaroni N，et al.Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties［J］.Cancer Res，2005，65(13):5506-5511.

［14］ Eramo A，Lotti F，Sette G，et al.Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population［J］.Cell Death Differ，2008，15(3):504-514.

［15］ Yin AH，Miraglia S，Zanjani ED，et al.AC133，a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells［J］.Blood，1997，90(12):5002-5012.

［16］ Bertolini G，Roz L，Perego P，et al.Highly tumorigenic lung cancer CD133+cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(38):16281-16286.

［17］ Beier D，Hau P，Proescholdt M，et al.CD133(+)and CD133(-)glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles［J］.Cancer Res，2007，67(9):4010-4015.

［18］ Miki J，F(xiàn)urusato B，Li H，et al.Identification of putative stem cell markers，CD133 and CXCR4，in hTERT-immortalized primary nonmalignant and malignant tumor-derived human prostate epithelial cell lines and in prostate cancer specimens［J］.Cancer Res，2007，67(7):3153-3161.

［19］ Goodell MA，Brose K，Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo［J］.J Exp Med，1996，183(4):1797-1806.

［20］ Hirschmann-Jax C，F(xiàn)oster AE，Wulf GG，et al.A distinct“side population”of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(39):14228-14233.

［21］ Chiba T，Kita K，Zheng YW，et al.Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties［J］.Hepatology，2006，44(1):240-251.

［22］ Szotek PP，Pieretti-Vanmarcke R，Masiakos PT，et al.Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(30):11154-11159.

［23］ Boyer LA，Lee TI，Cole MF，et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells［J］.Cell，2005，122(6):947-956.

［24］ Zhou Q，Chipperfield H，Melton DA，et al.A gene regulatory network in mouse embryonic stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(42):16438-16443.