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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 胸外科； 2 中心實驗室)

microRNA-451是長約22 nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過作用于靶mRNA使其降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而調(diào)控基因表達、細(xì)胞周期以及細(xì)胞的增殖與壞死[1]。蛋白激酶B(P-AKT)是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，活化的AKT通過磷酸化下游的許多靶蛋白，發(fā)揮其生物學(xué)活性，可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后加工，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡。肺移植已成為各種終末期肺部疾病的重要治療手段，而缺血再灌注損傷是影響肺移植成功率的最大制約因素[2]。近年來，隨著micro-RNA及其下游調(diào)節(jié)機制影響腫瘤細(xì)胞增殖的研究不斷深入，其在缺血再灌注損傷中的作用也越來越受到關(guān)注，但在肺缺血再灌注過程中，microRNA及其下游調(diào)節(jié)蛋白的表達變化尚少有報道?；蛐酒夹g(shù)研究結(jié)果顯示，缺血肺組織中microRNA-451的表達量上調(diào)2倍以上[3]。本實驗應(yīng)用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot方法，檢測缺血再灌肺組織中microRNA-451及p-AKT蛋白的表達情況。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康清潔級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量為250～300 g，均購自山東魯抗醫(yī)藥公司實驗動物中心；PrimeScript?RT reagent Kit及Premix Ex TaqTM，均購自大連寶生物工程有限公司；TaqMan?MicroRNA Assay Kit，購自Applied Biosystems公司；兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體和山羊抗兔單克隆抗體，均購自康維世紀(jì)公司；兔抗大鼠p-AKT多 克隆抗體，購自 Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

Wistar大鼠50只，隨機分為對照組、缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組，每組10只大鼠。麻醉大鼠，行氣管插管后接呼吸機，仰臥位固定大鼠，于胸骨左側(cè)第5肋間進胸，松解下肺韌帶，游離出肺門根部，手術(shù)中注意保護肺組織，避免組織損傷。予100 U肝素靜注，5 min后(肺中度膨脹時)，于肺門處用血管夾阻斷血流，手術(shù)后碘附水沖洗胸腔，無菌敷料覆蓋切口。對照組于松解下肺韌帶后取材，不作血流阻斷；缺血組于阻斷肺門1 h后取材；再灌注1、3、6 h組于阻斷肺門1 h后去除血管夾，恢復(fù)肺組織血供，分別于再灌注1、3、6 h后取材，取材前予生理鹽水沖洗肺組織。阻斷上、下腔靜脈血流處死動物。穿刺左心耳，經(jīng)右心室行壓力灌洗(30 mL生理鹽水，2.94 kPa)，完整取出左全肺后，置液氮中-80 ℃保存。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1總RNA、總蛋白提取及測定 用TRIzol及microRNA提取專用試劑盒，提取標(biāo)本肺組織的總RNA，紫外線分光光度計測定吸光度(A)值。蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑中研磨并超聲裂解肺組織，離心，加SDS后水浴，-20 ℃保存。

1.3.2microRNA-451蛋白表達檢測 采用RT-qPCR方法，通過microRNABase及相關(guān)文獻[4]獲取其引物序列。microRNA-451引物序列：5′-AAA-CCGUUACCAUUACUGAGUU-3′，應(yīng)用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒TaqMan?探針分析法進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照Premix Ex Taq及TaqMan?MicroRNA Assay Kit試劑說明書進行PCR標(biāo)準(zhǔn)程序擴增，U6為內(nèi)參(引物序列為5′-GTGCTCGCTTC-GGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATA-CAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAG-GATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-ATTT-3′)，檢測microRNA-451相對表達量。

1.3.3P-AKT蛋白表達檢測 采用Western blot方法，以GAPDH作為對照,行SDS-PAGE電泳。電泳完成后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，室溫下封閉2 h,TBST緩沖液洗3次,加入兔抗大鼠p-AKT多克隆抗體(1∶1 500)，4 ℃孵育過夜；用TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室溫孵育1 h；TBST及TBS各洗3次，ECL系統(tǒng)曝光顯影,凝膠分析系統(tǒng)分析p-AKT蛋白的表達。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗法，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 各組microRNA-451表達比較

對照組、缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組microRNA-451相對表達量分別為0.39±0.34、1.79±1.27、1.86±0.98、2.08±1.44、0.58±0.63。與對照組比較，缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組microRNA-451的相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，其中再灌注3 h組microRNA-451的表達量最高，差異有顯著意義(F=17 244.32,P<0.05)。

2.2 各組p-AKT蛋白表達比較

對照組、缺血組、再灌注1 h組、再灌注3 h組、再灌注6 h組的p-AKT蛋白相對表達量分別為0.32±0.01、0.18±0.02、0.16±0.01、0.13±0.01、0.21±0.02。對照組AKT蛋白相對表達量最高，再灌注3 h組表達量最低，差異有顯著性(F=136.02,P<0.05)。

3 討 論

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，具有高度保守的基因序列，在RNA聚合酶Ⅱ的催化下細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄出序列較長的pri-microRNA，經(jīng)過Drosha酶及Dicer酶的修飾可形成成熟的micro-RNA，它可與序列基本互補的mRNA結(jié)合，通過阻止蛋白質(zhì)翻譯過程或直接降解mRNA，實現(xiàn)基因表達的調(diào)控作用，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、新陳代謝等過程。NAN等[5]研究結(jié)果顯示，micro-RNA-451可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、增殖，促進細(xì)胞的凋亡。WANG等[6]研究結(jié)果顯示，microR-451 可靶向調(diào)控RAB14，從而顯著抑制非小細(xì)胞肺癌生長。BRANDRES等[7]研究顯示，microRNA-451在胃及結(jié)直腸癌中呈低表達，且表達水平與預(yù)后呈正相關(guān)，將pre-microRNA-451轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞中, 腫瘤細(xì)胞生長受到抑制。TIAN等[8]研究顯示，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中microRNA-451可通過CAB39抑制PI3K/AKT途徑，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。

AKT蛋白是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，它處于PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心部位，可通過PDK-1磷酸化Thr308、Ser473兩個位點后，實現(xiàn)完全激活，發(fā)揮生物學(xué)活性。近年來，對于p-AKT的研究不斷深入，大量研究證實，AKT蛋白具有促進細(xì)胞生長增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用[9]。已有研究結(jié)果顯示，p-AKT蛋白在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及結(jié)直腸癌等組織中均表達增高[10]。WIDMANN等[11]研究結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡時，AKT可出現(xiàn)水解現(xiàn)象，表達量降低。JETZT等[12]將AKT的磷酸化位點滅活，通過一種復(fù)制缺陷型腺病毒將失活的AKT轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。

本研究應(yīng)用RT-qPCR以及Western blot法，檢測microRNA-451及P-AKT蛋白在大鼠肺缺血再灌注組織中的表達情況，結(jié)果顯示兩者在表達上存在一定的相關(guān)性。結(jié)合相關(guān)文獻結(jié)果[8,13]，認(rèn)為microRNA-451可能通過調(diào)節(jié)p-AKT蛋白的表達對細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮作用。本文的實驗結(jié)果顯示，隨著缺血再灌注時間的延長，microRNA-451的表達呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢，而p-AKT蛋白的表達則是呈現(xiàn)先下降后上調(diào)的相反的結(jié)果，推斷microRNA-451促進細(xì)胞凋亡的作用可能是通過調(diào)節(jié)p-AKT蛋白通路實現(xiàn)的。這有可能為肺缺血再灌注損傷的預(yù)防及治療提供一條新的思路。但是，microRNA-451對p-AKT蛋白調(diào)節(jié)的具體機制尚需要進一步研究。microRNA-451是否存在其他靶點對缺血再灌注損傷進行調(diào)控及p-AKT蛋白調(diào)控細(xì)胞周期的具體機制目前尚未得到證實。

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