，，

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，山東 青島 266003)

腸道病毒71型(EV71)屬小RNA病毒科[1]，主要引起手足口病，大多數(shù)病情輕微，具有自限性。EV71與腸道病毒家族其他成員相比，具有明顯的嗜神經(jīng)性，易引起無(wú)菌性腦膜腦炎、腦干腦炎、腦炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重者可致肺水腫、肺出血危及病兒生命[2-3]。自1969年首次報(bào)道以來(lái)，在世界范圍內(nèi)已引起多次爆發(fā)和流行[4]，嚴(yán)重威脅兒童健康。目前對(duì)于EV71致感染的機(jī)制，尤其中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的遺傳易感因素尚未明確。白細(xì)胞介素10(IL-10)可抑制炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，具有強(qiáng)有力的免疫及炎癥抑制功能，在多種病毒感染的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[5-6]。研究顯示，IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-592C/A(IL-10-592C/A)位點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)影響IL-10的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響IL-10的表達(dá)及生物活性[7]。本課題通過(guò)對(duì)IL-10-592C/A位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行分析，以進(jìn)一步了解EV71腦炎的遺傳易感因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年6月—2012年3月，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和青島市婦女兒童醫(yī)院住院的EV71感染病兒共103例，男63例，女40例；年齡為1.3～7.5歲；其中輕癥病兒75例，重癥[8]病兒28例。診斷均符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南(第2010版)》的標(biāo)準(zhǔn)，且重癥病兒RT-PCR檢測(cè)急性期糞便及腦脊液EV71病毒核酸陽(yáng)性[9]。正常對(duì)照組135例，男83例，女52例；年齡2.7～8.3歲；為同期于兒童保健科體檢且臨床無(wú)感染癥狀的兒童，血常規(guī)及生化指標(biāo)檢查均在正常參考范圍內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取 入院時(shí)采集病兒靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃暫存?zhèn)溆?。采用Omega公司 (美國(guó))全血DNA提取試劑盒，提取抗凝全血基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2Hardy-Weinberg平衡定律檢測(cè) 根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律對(duì)EV71感染組與對(duì)照組IL-10-592C/A位點(diǎn)基因進(jìn)行檢驗(yàn)，P>0.05，提示兩組人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

1.2.3IL-10-592C/A位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè) IL-10-592C/A位點(diǎn)引物由上海天昊生物科技公司設(shè)計(jì)完成。取DNA樣本1 μL，加入10 g/L的瓊脂糖后進(jìn)行電泳，對(duì)其樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計(jì)，然后將樣本稀釋到工作濃度10 μg/L。取iMLDRTM多重SNP分型試劑盒中的多重PCR引物混合物1 μL、2×PCR Master mix 5 μL、樣本DNA 1 μL、ddH2O 3 μL混勻，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并純化。將試劑盒中的10×連接緩沖液2 μL、高溫連接酶0.2 μL、連接引物混合液1 μL與純化后多重PCR產(chǎn)物3 μL、ddH2O 3.8 μL混勻。然后94 ℃ 1 min,56 ℃ 4 min，共 35 個(gè)循環(huán)；最后4 ℃下保存。取0.5 μL稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz 500 Size Standard熒光內(nèi)標(biāo)及9 μL高度去離子甲酰胺混勻混勻，95 ℃變性5 min后上測(cè)序儀(ABI3130XL)進(jìn)行測(cè)序。收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.0(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行分析,采用連接產(chǎn)物的熒光標(biāo)記特點(diǎn)及長(zhǎng)度區(qū)分等位基因及不同位點(diǎn)(由上海天昊生物科技公司完成)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間基因型和等位基因頻數(shù)分布比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

EV71感染病兒與對(duì)照兒童均存在IL-10基因多態(tài)性，IL-10-592C/A位點(diǎn)基因型分布均以CC型最為常見(jiàn)，等位基因型以C型多見(jiàn)，AA基因型分布頻率低，將AA基因型與AC基因型合并進(jìn)行分析。EV71感染組IL-10-592C/A位點(diǎn)基因型分布為CC型74例、AC+AA型29例，等位基因分布為C型148例、A型58例；對(duì)照組該位點(diǎn)基因型分布CC型為97例、AC+AA型為38例，等位基因分布為C型226例、A型44例。輕癥組CC型60例、AC+AA型15例，等位基因分布為C型120例、A型30例；重癥組CC型14例、AC+AA型14例，等位基因分布為C型28例、A型28例。EV71感染病兒IL-10-592C/A位點(diǎn)基因型CC、AC+AA分布與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，但EV71感染重癥組病兒基因型AC+AA的分布與輕癥組病兒比較差異有顯著性(χ2=9.071，P<0.05)；EV71感染組A等位基因分布頻率與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。但重癥組A等位基因頻率分布與輕癥組比較差異有顯著性(χ2=18.143，P<0.05)。

3 討 論

EV71致兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害可引起腦炎、無(wú)菌性腦膜腦炎、腦脊髓炎及急性遲緩性麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病[10]，致死率及致殘率較高。目前，EV71致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機(jī)制尚未完全明確，不同個(gè)體感染EV71后其臨床表現(xiàn)、病情經(jīng)過(guò)及預(yù)后迥異，造成這種差異的原因除了病毒本身的因素外，還包括不同宿主基因組對(duì)于病毒的易感性及免疫狀態(tài)的差異。因此，從宿主基因角度探討EV71致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機(jī)制，可以進(jìn)一步明確EV71易感性的遺傳學(xué)標(biāo)志。本研究對(duì)EV71感染病兒103例及健康兒童135例外周血白細(xì)胞中IL-10-592C/A位點(diǎn)的基因型檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-10-592C/A位點(diǎn)AC+AA基因型及A等位基因?yàn)樵贓V71感染后發(fā)展為重癥腦炎的易感基因，結(jié)果提示A等位基因頻率增高與EV71感染及感染后致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥相關(guān)，而該位點(diǎn)CC基因型攜帶者感染EV71后不易發(fā)展為重癥腦炎。

EV71腦炎是腦實(shí)質(zhì)的炎癥性疾病，機(jī)體的炎癥反應(yīng)及免疫狀態(tài)的基因差異對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后起著重要的作用，炎癥因子尤其是具有多效能的細(xì)胞因子IL-10在機(jī)體炎癥反應(yīng)中起著重要作用。由于IL-10是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的樞紐之一且具有抗炎因子作用，在EV71腦炎的感染及疾病的轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮一定作用。研究顯示，IL-10-592C/A位點(diǎn)為STAT3轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合位點(diǎn)，此位點(diǎn)存在C→A的突變，它可能為一種功能性的突變，其變異可使IL-10的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，mRNA轉(zhuǎn)錄活性降低[7]，導(dǎo)致IL-10合成減少，不能有效抑制EV71腦炎腦實(shí)質(zhì)的炎癥反應(yīng)。故IL-10-592C/A位點(diǎn)基因型為AC+AA者與基因型為CC者比較，合成的IL-10濃度低且活性低，IL-10啟動(dòng)子區(qū)-592C/A位點(diǎn)C→A的基因多態(tài)性可導(dǎo)致IL-10的表達(dá)水平或其活性的改變，血液中低濃度的IL-10不能起到有效地抑制炎癥反應(yīng)的作用，導(dǎo)致白細(xì)胞活化增強(qiáng)，血管通透性更加明顯，致腦實(shí)質(zhì)的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，引起腦實(shí)質(zhì)更明顯的炎癥性損害。

本文研究結(jié)果顯示，IL-10-592C/A位點(diǎn)基因型AC+AA攜帶者及A等位基因?yàn)镋V71感染后發(fā)展為重癥的危險(xiǎn)因素，而基因型CC及C等位基因?yàn)椴翰灰字轮匕Y的保護(hù)基因。但由于遺傳、機(jī)體免疫功能狀態(tài)及病毒毒力及環(huán)境因素共同作用于機(jī)體致EV71感染，要確切了解IL-10的基因多態(tài)性與EV71致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機(jī)制，尚需更深入的研究。

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