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(青島大學附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 青島 266071)

在世界范圍內，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第9位[1]。在我國，男性膀胱癌發(fā)病率居全身腫瘤的第8位，女性為第12位[2]。膀胱癌中移行細胞癌最多見，其發(fā)病率和復發(fā)率均較高，受到廣泛關注[3]。轉移是決定浸潤性膀胱癌的侵襲性及臨床預后最重要的臨床病理特征，30%的浸潤性膀胱癌病人確診時鏡下已發(fā)現(xiàn)轉移，超過90%的病人最終死于腫瘤轉移。膀胱腫瘤又為異質性腫瘤，TNM系統(tǒng)不能完全評價腫瘤的轉移潛能。腫瘤間質是腫瘤不可或缺的組成部分，其對腫瘤的惡性程度、轉移潛能的調控機制一直是腫瘤學研究的熱點。本研究以膀胱腫

瘤間質蛋白作為研究對象，以放射性核素相對標記與絕對定量技術(iTRAQ法)獲取腫瘤蛋白表達譜，并與尿液的蛋白質表達譜進行比對，探討從尿液中發(fā)現(xiàn)反映膀胱癌惡性轉移潛能的生物標記組的可能性?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

按照“知情同意”原則收集高、中、低轉移潛能浸潤性膀胱癌標本各10例。病人因浸潤性膀胱癌在我院治療，在泌尿外科行全膀胱切除術。術前均未進行化療或放射治療。術后10 min內取腫瘤組織，無菌PBS沖洗后，液氮冷凍保存?zhèn)溆?。標本經兩名副高級以上病理學專家檢查確診，并根據回顧性分析中的主流統(tǒng)計學模型預測指數(PI)收集標本，根 據PI的整體分布將病人的轉移風險分為3組。

1.2 激光捕獲顯微切割技術(LCM)切割腫瘤組織

LCM使用PixCell Ⅱlaser capture microdissection system 和CapSure LCM Macrocaps (Arcturus Engineering公司)，按照文獻描述步驟操作。根據光鏡下樣本情況及獲得最佳捕獲效率設定儀器參數:Pulse Duratio 2.0 ms，Beam-Diameter 15 μm，Beam Power 70 mW。每例標本捕獲間質細胞25 shootings，顯微鏡下檢查切割所獲得的細胞群均具有98%的同源性。

1.3 胰酶蛋白酶酶解蛋白

酶解蛋白質混合物及二維液相色譜分離多肽混合物，經LCM技術處理后放入沉淀溶液中,-20 ℃至少12 h。以含體積分數1.00的丙酮及體積分數0.70的乙醇沖洗片狀沉淀物，采用Bio-Rad protein assay kit檢測可溶性蛋白質濃度。二硫蘇糖醇濃縮可溶性蛋白質200 μg，最終濃度為20 mmol/L，然后經40 mmol/L碘乙酰胺烷基化。Microcon-10超濾去除甲苯胺藍并且脫鹽后，蛋白質混合物中加入測序級胰蛋白酶(蛋白質混合物∶測序級胰蛋白酶=1∶30)37 ℃過夜。

1.4 肽段標記

各組樣品分別取100 μg，按照試劑盒iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進行標記。用iTRAQ溶解緩沖液溶解；隨后分別在iTRAQ試劑115、116和117內各加入60 μL無水乙醇,用處理后的iTRAQ試劑115、116和117分別標記高危、中危、低危肽段混合物，室溫條件下反應1 h后，把4組標記樣品混合，加入10倍體積的SCX上樣緩沖液。

1.5 SCX分級

取標記后的所有肽段混合，應用儀器AKTA Purifier 100(GE Healthcare)進行SCX預分級。收集穿流及洗脫fraction約30份，根據SCX色譜圖合并成10份，凍干后C18 Cartridge脫鹽。

1.6 毛細管高效液相色譜

每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。

1.7 質譜鑒定

每份樣品經毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質譜儀(Thermo Finnigan)進行質譜分析，按照機器操作步驟說明進行操作。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集10個碎片圖譜。采用美國Finnigan公司提供的SEQUEST軟件搜索碰撞誘導裂解后的串聯(lián)質譜圖。搜索使用的數據庫為IPI human蛋白庫。

1.8 基因本體論(GO)分析

對我們研究的差異表達蛋白譜進行深入分析，GO蛋白軟件用于GO濃集-缺失表達分析獲得的生物學數據，對于濃縮分析，我們需要一個測試數據集和一個GO注釋的包含完整的人類蛋白質組的參考集。按照GO網頁上的說明，從EBI GOA 80.0提取出的有關GO注釋創(chuàng)造出了自定義的GO的參考集。

1.9 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析采用SPSS version 16.0軟件，應用卡方檢驗進行比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 蛋白質鑒定

各組樣本中分別鑒定出蛋白991/964、957/1 022、1 086/979個。為了揭示間質細胞的遺傳特點并降低數據的復雜性，我們只分析3組樣本中共表達的943個蛋白。差異表達蛋白中的最大和最小相對分子質量分別為5 630和629 090，等電位(PI)分布范圍為3.67～11.36。

2.2 蛋白質濃集-缺失表達分析

在943個蛋白質中具有生物學途徑、細胞成分注解的蛋白質分別為760、804個。通過與國際蛋白質索引(IPI)的完整列表進行對比，生物學途徑中濃集-缺失的分支術語為55/11，細胞成分中濃集-缺失的分支術語為43/8。

3 討 論

膀胱腫瘤轉移潛能存在異質性，獲得體現(xiàn)腫瘤轉移潛能的細胞純系是進行本研究的關鍵步驟，為達到此目的，我們實驗第一步采取了LCM技術，并獲得足量蛋白進行后續(xù)iTRAQ蛋白質組學分析。LCM聯(lián)合iTRAQ技術，最終我們獲得了腫瘤間質中943個差異表達蛋白，蛋白質中具有生物學途徑、細胞成分注解的蛋白質分別為760、804個。其中的部分蛋白已經被報道與膀胱癌轉移潛能密切相關。例如，F(xiàn)SCN1被證實在浸潤性膀胱癌組織標本及相應尿液標本中100%過度表達[4]；在高級別及多發(fā)膀胱腫瘤組織中HMOX1 mRNA的表達顯著高于低級別及單發(fā)者，其可作為預測腫瘤復發(fā)及轉移的生物標記[5]；應用免疫組織化學技術檢測膀胱腫瘤組織中蛋白表達情況，ANXA1表達顯著增加，其表達水平與膀胱腫瘤的預后密切相關[6]。

既往研究中已經證實,腫瘤間質在腫瘤發(fā)生和發(fā)展及轉移過程中發(fā)揮重要作用。人原發(fā)性結直腸腫瘤和間質細胞具有多種異質性分泌物，其通過ELR+CXC趨化因子高度分泌，作用于CXCR1和CXCR2，從而影響腫瘤的生長和惡化[7]。葡萄膜黑色素瘤5年病死率高達30%，死因是由于肝臟轉移,而腫瘤間質高表達PEDF，可抑制小鼠模型肝轉移的進展[8]。近期研究結果顯示，在結直腸癌的遠處轉移中高表達轉化生長因子-β誘導的腫瘤基質成纖維細胞分泌白細胞介素11是一個必要的先決條件[9]。本研究通過檢測高、中、低浸潤性膀胱癌間質中差異表達的蛋白質來判定腫瘤病人轉移的風險，為腫瘤的綜合治療提供幫助。

細胞增殖、分化、黏附等相關蛋白的研究一直是腫瘤研究的熱點，很多蛋白已經被驗證同腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結果提示，此類蛋白的表達差異決定了腫瘤的轉移潛能，并可以用于評判腫瘤的轉移風險。生物學途徑中，以細胞增殖、細胞分化、細胞黏附及細胞行為為例，對比已發(fā)表文獻，發(fā)現(xiàn)這些蛋白的濃集表達符合惡性腫瘤的生物學特點。在細胞增殖過程中，PRDX1在膽囊癌組織中表達異常，與膽囊癌進展及預后關系密切[10]；在前列腺癌組織中，PEDF通過直接誘導單核細胞或巨噬細胞遷移和分化成m1型細胞而發(fā)揮抗腫瘤作用[11]；KHDR1在鱗狀細胞癌組織中高度上調，其在膀胱癌的進展中可能發(fā)揮重要作用[12]。歐洲腫瘤實驗中心的癌癥臨床試驗結果顯示，在33例腫瘤病人中檢測到AINX的表達，其可影響間變性少突膠質細胞瘤化療效果并可作為獨立的預后因素[13]；CALR表達水平的變化可能會影響膀胱癌在體外和體內的進展。以RNA和基質金屬蛋白酶2、9為檢測目標，以提高常規(guī)尿液細胞學診斷效能的研究中，MMP9預測膀胱腫瘤尿細胞學靈敏度為90%[14]。這些蛋白密切參與了各類腫瘤的生物學過程，在腫瘤的細胞增殖、分化、黏附過程中發(fā)揮作用，在一定程度決定了腫瘤的轉移風險。

根據GO細胞組分濃集-缺失分析的定義，濃集的特定蛋白功能活躍，并且該成分的蛋白組更容易通過生物流體研究呈現(xiàn)，更可能被確認為生物標記物。在溶酶體術語中，已經證實乳癌、肺癌和腦癌的浸潤轉移過程中各種溶酶體蛋白高度表達，超過正常水平；核內體蛋白CATB在腫瘤細胞侵犯質膜的過程中可降解層粘連蛋白和基底膜成分，從而促進腫瘤的浸潤[15]。我們研究的結果表明，特定蛋白在腫瘤的浸潤過程中功能活躍，可用來作為生物標記。

總之，LCM聯(lián)合iTRAQ法分析不同轉移潛能浸潤性膀胱癌間質蛋白的表達譜特征，結果可靠、有效。細胞的生物學途徑和亞細胞結構決定腫瘤轉移潛能，并可以成為潛在的可以從尿液中檢出的生物學標記物。

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