李珍美玉，顧 蕓，易 晟

（南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇226001）

·綜 述·

細胞外基質在組織工程中的應用

李珍美玉，顧 蕓，易 晟

（南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇226001）

細胞外基質（ECM）作為一種特殊的天然生物衍生材料，為細胞提供了生物物理機械性支持，并且可為組織的再生提供良好的微環(huán)境。近年來，細胞外基質已廣泛應用于組織工程的再生修復，并展現(xiàn)出了其良好的應用前景。本文對細胞外基質的主要成分、功能及細胞外基質在組織工程，尤其是在組織工程神經(jīng)方面的研究進行了綜述。細胞外基質為組織工程材料臨床領域的應用提供了嶄新的手段和方法。

細胞外基質；膠原蛋白；非膠原糖蛋白；糖胺聚糖；組織工程；神經(jīng)修復

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是由膠原、非膠原糖蛋白和糖胺聚糖等大分子構成的復雜生物網(wǎng)絡結構。細胞外基質作為一種特殊的天然生物衍生材料，為細胞的生長提供了物理支持和適宜的場所，并通過信號轉導調(diào)控細胞的粘附、生長、增殖和分化。在組織胚胎的發(fā)生發(fā)展、組織細胞的生長和分化、組織創(chuàng)傷修復和再生、細胞的衰老和癌變等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[1]。

1 細胞外基質

1.1 膠原蛋白 膠原蛋白是結構蛋白質，具有α鏈組成的三股螺旋構象（即膠原域），按其功能分為成纖維膠原和非纖維膠原。成纖維膠原其膠原域是由長而不中斷的三股螺旋組成，包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅺ型，主要構成細胞外基質中的纖維。非纖維膠原其膠原域中的3股螺旋是不連續(xù)的，至少存在1個中斷處，主要包括Ⅳ型（基底膜型），Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅻ，ⅩⅣ，ⅩⅥ，ⅩⅨ型（RH型），主要結合于纖維表面或形成網(wǎng)狀結構。Itoh等[2]用Ⅰ～Ⅲ型膠原構建神經(jīng)支架材料，施萬細胞在支架材料上生長狀態(tài)良好，提示其具有良好的生物相容性。MaW等[3]將胚胎大鼠神經(jīng)皮層或亞皮層的神經(jīng)干細胞和祖細胞加入具有三維結構的膠原凝膠體中，聯(lián)合培養(yǎng)在含有成纖維細胞生長因子（bFGF）的牛血清介質中。第5天時細胞迅速增殖并且出現(xiàn)神經(jīng)巢蛋白，第14天時許多分化細胞出現(xiàn)。實驗結果顯示，其中部分是少突膠質細胞。王樹森等[4]以硫酸肝素復合膠原蛋白結合冰凍干燥技術制備神經(jīng)組織工程支架材料，施萬細胞在支架材料微管內(nèi)平行排列生長，形成類似于神經(jīng)基底膜與施萬細胞形成的賓格內(nèi)帶（Büngner帶）。膠原構建的生物支架材料也成功應用于動物模型。Nakamura 等[5]將膠原填入聚乙醇酸導管中，用于橋接比格犬15mm腓神經(jīng)缺損，術后神經(jīng)沿支架生長良好。術后3周可長到遠端形成重支配，術后6個月測定其復合神經(jīng)神經(jīng)動作和感覺電位，顯示實驗組的延遲時間短于自體神經(jīng)組，峰值高于自體神經(jīng)組，髓鞘直徑大于自體神經(jīng)組。

1.2 非膠原糖蛋白 （1）層粘連蛋白（Laminin，LN）∶由一條重鏈（α）和二條輕鏈（β、γ）通過二硫鍵交聯(lián)而成，外形呈十字形，三條短臂各由三條肽鏈的N端序列構成，共含有15個亞型。層粘連蛋白作為基底膜的主要成分，可引導和調(diào)控神經(jīng)生長因子的表達。在軸突萌芽階段能夠調(diào)節(jié)施萬細胞的功能，其缺失會引起一定程度的髓鞘形成減少和軸突分選不利[6]。近幾年已有研究證實，LNα2，LNγ1，LNα4發(fā)生缺失或突變均不同程度的影響髓鞘形成[7]。Milner 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，LN-1，LN-2（merosin）和纖維連接蛋白能夠促進施萬細胞的遷移。Cheng等[8]將層粘連蛋白和鼠尾膠覆蓋在可吸收材料上，并將施萬細胞種于表面。發(fā)現(xiàn)材料對施萬細胞有很好的吸附性，且有

利于施萬細胞的增殖和遷移，培養(yǎng)2周后增殖后的施萬細胞能形成很好的賓格內(nèi)帶，并產(chǎn)生更多的基質成分。將移植物用于橋接兔的坐骨神經(jīng)缺損，8周后損傷遠端可見軸突再生。Matsumoto等[9]將人胎盤層粘連蛋白和膠原復合在聚乙醇酸支架上，橋接了犬的80mm腓神經(jīng)缺損，術后1年修復效果良好。（2）纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）∶廣泛存在于動物組織和組織液中，可分為可溶性和不可溶性兩類。可溶性纖維連接蛋白即血漿纖維連接蛋白，主要分布于血漿及各種體液中。不溶性纖維連接蛋白即細胞纖維連接蛋白，主要存在于細胞外基質和細胞表面。纖維連接蛋白是一種二聚體，它由2條多肽鏈通過近C端的2個二硫鍵相連而成，含有6個結構域。各個結構域分別執(zhí)行不同的功能，可分別與細胞、膠原、DNA和肝素結合。在細胞外基質中，完整的纖維連接蛋白基質對于成熟膠原的形成和穩(wěn)定都是必需的。纖維連接蛋白分子折疊成球狀結構域用于綁定整合素、硫酸乙酰肝素、透明質酸和其他纖維連接蛋白分子，從而使自身纖維發(fā)生進一步組裝。纖維連接蛋白通過自身聚合方式形成結締組織中不溶性的細胞外基質。另一種不溶性纖維連接蛋白，通過與整合素（通常是整合素ɑ5β1）受體結合來綁定在細胞表面。Christopher[10]證明在細胞外基質中有3種纖維連接蛋白纖維，1種纖維連接蛋白在細胞外基質中形成網(wǎng)絡，另外兩種可聯(lián)合整合素β1，其中1種纖維連接蛋白進一步形成細胞的粘附斑。近年來，細胞外基質中的纖維連接蛋白也在組織工程中發(fā)揮了重要作用。Gu等[11]研究證實，細胞外基質中大量的層粘連蛋白和纖維連接蛋白促進了軸突的延伸和生長。將沉積層粘連蛋白和纖維連接蛋白等細胞外基質的支架材料用于修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損，修復效果良好。（3）糖胺聚糖∶周圍神經(jīng)系統(tǒng)的細胞外基質成分中的糖胺聚糖分，主要包括硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素和透明質酸等，主要通過葡萄糖胺聚糖的側鏈和層粘連蛋白發(fā)生相互作用。蛋白聚糖（Proteoglycan，PG）主要由許多葡萄糖胺聚糖通過末端Gal-Gal-Xyl與核心蛋白中絲氨酸殘基共價結合形成生物大分子。分布于胞外基質中的蛋白聚糖主要為CS/KS-PGs（Aggrecan），CS/DS-PGs（Biglycan/PG-Ⅱ，Decorin/PG-Ⅰ，Verican），CS-PGs（Neurocan），KSPGs（Fibromodulin，Lumican），HS-PGs（Perlecan）。聚集蛋白是1種常見的糖胺聚糖，見于數(shù)種組織的基底膜,尤其在神經(jīng)肌接頭處,是突觸后膜特化形成的重要信號分子。在肺、腎、腦等其它非肌肉組織表達的聚集蛋白異質體,能與肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖高度親和,可能與組織的機械性協(xié)調(diào)一致有關。梁安霖等[12]研究表明，透明質酸可以減少瘢痕形成。（4）其他成分∶細胞外基質中還包含玻連蛋白、彈性蛋白和血栓骨架蛋白等。除了這些基本成分，仍保留了部分天然組織中的一些重要生物活性因素。如透明質酸酶、血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子β、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、表皮生長因子及骨形態(tài)發(fā)生蛋白4等。Voytik-Harbin等[13]從小腸粘膜下基質中，成功提取出成纖維細胞生長因子和轉化生長因子β兩種生長因子。在胞外基質支架材料降解過程中，血管內(nèi)皮生長因子，成纖維細胞生長因子和轉化生長因子β等許多生長因子可從其結合蛋白上分離被激活。在組織再生過程中促進血管的生成、有絲分裂的發(fā)生和細胞的分化。Hoganson等[14]研究證實脫細胞的豬的真皮，保留許多天然胞外基質蛋白如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白和透明質酸等。但同時還保留一些細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子和轉化生長因子β。對其機械強度如抗拉強度、縫合處耐受力的測定結果顯示其具有良好的機械強度，說明細胞外基質中的細胞因子發(fā)揮重要作用。

**[作者簡介]李珍美玉，女，漢族，山東臨沂人，生于1991年3月，碩士研究生。研究方向∶細胞外基質在組織周圍神經(jīng)中的應用。 通信作者∶易晟，博士，E-mail:syi@ntu.edu.cn

1.3 體外脫細胞方法的選擇 天然的細胞外基質材料可通過脫細胞的方法從離體的組織獲取和制備，常見的處理方法有物理方法、化學方法和生物方法。（1）物理方法主要包括反復凍融、機械刮除、熱處理、機械攪拌和漂洗等。反復冷凍法的基本原理是通過反復冷凍使細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，從而破壞細胞膜，導致細胞裂解。主要適用于肌腱、韌帶及神經(jīng)等組織的脫細胞處理。機械刮除法主要用于小腸等組織的脫細胞處理，通過機械刮除粘膜層、漿膜層和肌層，去除主要細胞成分，保留粘膜下層作為細胞外基質材料。物理方法一般無法徹底去除組織中的細胞成分，需要進一步借助化學方法或生物學方法處理。（2）化學方法主要是利用一種或幾種化學試劑來破壞細胞的結構，使細胞裂解從而達到脫細胞的目的。常用的化學試劑主要包括EDTA、脫氧膽酸鈉和洗滌劑。常用洗滌劑有非離子型表面活性劑Triton X-100和離子型表面活性劑SDS。（3）生物方法主要包括酸堿性

試劑和蛋白水解酶等。其中酶水解法是較為常用的方法。蛋白水解酶主要包括胰蛋白酶、膠原酶、RNase 和DNase。酶水解法脫細胞效果顯著。但是當酶的濃度過高或是作用時間過長時，在破壞細胞結構的同時可能會破壞生物活性物質。包括細胞外基質中的膠原蛋白、氨基葡聚糖等。因此需根據(jù)需要來確定酶處理的濃度、溫度和作用時間[15]。

去細胞方法的不同可能會影響到細胞外基質的組成、細胞外基質的機械性能和生物特性，也會對植入異體后的宿主反應有一定的影響。例如，經(jīng)過凍干處理與未經(jīng)脫水處理的小腸粘膜，脫細胞基質表現(xiàn)出不同的纖維動力學特征。最終滅菌方法的選擇也會影響其機械強度和生長因子生物活性的發(fā)揮，經(jīng)過氧乙酸的處理和環(huán)氧乙烷的滅菌后，小腸粘膜比未經(jīng)任何處理的小腸粘膜減少8%的轉化生長因子β1[16]。Itoh等[17]研究指出，經(jīng)過紫外線交連后，膠原分子吸附神經(jīng)營養(yǎng)因子、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的能力增強，支架管道的物理性質得到改善，從而促進了施萬細胞的遷徙和增殖以及生長錐和再生管道的粘附，最終促進了軸突的延伸和成熟。

2 細胞外基質與組織工程

2.1 細胞外基質的優(yōu)良特性 目前合成支架材料的優(yōu)點在于可控組成、可降解性及物理性能。缺點在于缺乏組織器官特定的結構及特定細胞的生態(tài)位。天然細胞外基質既具有合成支架材料的優(yōu)點，又克服了以上缺點，且具有較低的免疫原性及優(yōu)良的生物學特性。

實驗證實植入宿主體內(nèi)的細胞外基質支架材料，在28天時降解率可超過50%，在60天時可得到完全降解，植入材料可被新的組織完全取代。95%的細胞外基質代謝產(chǎn)物經(jīng)過尿排泄，不會被其他組織重新循環(huán)利用[18]。天然細胞外基質的迅速降解是通過一些酶和細胞的活動實現(xiàn)的，也可通過細胞外基質中的組成分子有規(guī)律的釋放。細胞外基質中某些分子釋放一直持續(xù)到細胞外基質材料完全降解。更為重要的是，降解過程中釋放的分子介導接下來一系列的組織器官重塑過程。在長期的組織再生過程中，降解過程中所產(chǎn)生的某些肽類引發(fā)并維持了骨髓來源的細胞的循環(huán)招募[18]。

由于細胞外基質蛋白是保守的蛋白，種屬差異小，通過將異種的或同種異體的細胞成分去掉后，可獲得最低免疫原性，結構完好的天然支架材料。來源于豬的脫細胞小腸粘膜下層，在異種移植實驗中表現(xiàn)為無免疫原性，不會誘發(fā)免疫排斥反應，可作為異種脫細胞生物支架材料[19]。

細胞外基質的生物學特性，體現(xiàn)在可以通過整合素和細胞表面受體與特定組織細胞外基質中的配體作用實現(xiàn)一系列的活動。比如可將細胞分泌的物質呈遞給各個組織或器官的歸巢細胞，從而成為維持組織細胞特異性表型的理想支架材料?？捎绊懠毎麅?nèi)的信號通路，以及特定組織中的細胞分化和細胞增殖。近年來許多不同的脫細胞組織，已被證實具有促進損傷修復和組織再生的能力。除了提供結構上的支持，基質中大量的纖維成分能夠可逆地結合生長因子和細胞因子，從而影響巨噬細胞的活動。同時組織再生過程中，這些因子也在組織周圍的信號通路中發(fā)揮作用，介導細胞的分裂遷移和招募[20]。

2.2 細胞外基質在組織生成、修復、再生中的作用在胚胎發(fā)育期，細胞外基質在介導生物物理刺激、傳導生化分子信號、形成空間結構等方面發(fā)揮重要作用[21]。層粘連蛋白，在原腸胚形成期有助于細胞的粘附和增殖，纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅳ和硫酸乙酰肝素糖胺聚糖在發(fā)育過程中形成較晚。之后一些基質中結構成分，如基底膜逐漸形成。細胞外基質中特定的結合位點，能夠引導器官的發(fā)育和成熟。如纖維連接蛋白可作為一個配體，引導分支形態(tài)的發(fā)生。

細胞外基質在組織再生中發(fā)揮重要作用，其破壞或是產(chǎn)生過量均會影響組織的損傷修復。骨膜蛋白，通過調(diào)節(jié)瓣膜和腱索膠原蛋白的表達和構像，來支持心臟內(nèi)膜的重塑發(fā)揮心臟瓣膜的作用。在創(chuàng)傷修復過程中，細胞外基質的毀壞導致其失去機械支持能力。細胞外基質介導的應力應變，在組織修復和再生過程中也發(fā)揮重要作用。Venkatachalam MA等1978年報道急性腎小管壞死，壞死的腎小管細胞會從基底膜上脫離，然后幸存腎小管內(nèi)皮細胞，在基底膜上能夠經(jīng)過去分化和增殖，恢復腎小管的完整性。同時如產(chǎn)生過量細胞外基質，修復過程就會變得異常活躍。這是因為這會導致組織結構的扭曲，成為修復障礙，甚至會發(fā)展成為一種自身疾病狀態(tài)，如組織的纖維化等。鑒于細胞外基質在組織創(chuàng)傷和修復中的作用和其優(yōu)良的特性，細胞外基質被廣泛應用于

組織工程生物支架材料。

2.3 細胞外基質應用于組織工程 Grillo等1964年最先對皮膚組織進行脫細胞處理，獲取了脫細胞的皮膚組織。之后陸續(xù)出現(xiàn)各種脫細胞生物材料，如脫細胞的心血管系統(tǒng)、小腸粘膜下層、泌尿系統(tǒng)、軟骨組織、心臟瓣膜、膀胱、心包、腦、腹膜間皮、小腸、真皮。

2.3.1 真皮∶近年來，脫細胞真皮因其生物相容性良好、可有效引導宿主的組織生成的特性，臨床上在燒傷、腹疝修補術和整容外科方面得到廣泛應用。Wainwright[22]應用脫細胞異體真皮進行復合移植覆蓋Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，取得了良好的修復效果。Feng等[23]首先研制出脫細胞異種（豬）真皮基質并成功應用異種真皮與自體薄皮片復合移植修復深度燒傷創(chuàng)面，隨后在國內(nèi)的臨床上得到廣泛應用。

2.3.2 小腸粘膜∶脫細胞的小腸粘膜組織是應用最為廣泛的細胞外基質材料。來源于豬的小腸粘膜經(jīng)過脫細胞處理后，可應用于多種哺乳動物的缺損組織的重塑和再生。Gu等[24]對豬小腸粘膜下層進行脫細胞處理后用于修復兔跟腱缺損，術后未發(fā)現(xiàn)明顯炎癥反應及排斥反應。術后16周小腸粘膜下基質為宿主肌腱完全替代，對其組織結構和力學性能進行檢測，結果顯示再生肌腱與正常肌腱極其接近。

2.3.3 中樞神經(jīng)∶Crapo等[25]對豬的視神經(jīng)、脊髓、大腦進行脫細胞處理，成功獲取了幾種中樞神經(jīng)的細胞外基質。實驗證實其中含有支持神經(jīng)生長的蛋白和生長因子。實驗通過將PC12細胞種于脫細胞的脊髓，證實了其可利于細胞向神經(jīng)樣細胞分化。由此結果顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞外基質能夠為中樞神經(jīng)的再生發(fā)揮組織特異性的優(yōu)勢，有助于中樞神經(jīng)損傷后的功能恢復。Liu等[26]通過脫細胞的脊髓聯(lián)合間充質干細胞，用于修復大鼠脊髓缺損。運用BDA示蹤劑示蹤實驗結果顯示，有髓軸突成功長入到脫細胞的脊髓支架上，促進了損傷部位的軸突再生。并且為其提供了有利的神經(jīng)營養(yǎng)微環(huán)境，特別是損傷部位大量的少突細胞能夠促進宿主神經(jīng)細胞的遷移和增殖，并且可見明顯的髓鞘再生。

2.3.4 周圍神經(jīng)∶施萬細胞表面的整合素與細胞外基質之間的多重作用，有助于髓鞘形成過程中施萬細胞的遷移。Mackinnon等[27]將高密度的施萬細胞種于聚乙醇酸支架并植入裸鼠背部，6周后取出聚乙醇酸支架用于橋接大鼠的坐骨神經(jīng)缺損，2個月后通過步態(tài)分析和透射電鏡等評價其修復效果。軸突數(shù)目及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)均優(yōu)于硅膠管組，和自體神經(jīng)組無顯著差異。研究者認為外源性施萬細胞分泌的細胞外基質為損傷部位提供大量的生長因子，很好地促進神經(jīng)的再生。Keilhoff等[28]將膠原I/Ⅲ型作為神經(jīng)組織工程中的細胞外基質材料，聯(lián)合施萬細胞構成一種復合物材料，植入Wistar雄性大鼠體內(nèi)。施萬細胞能夠很好的粘附、生長、擴散，并出現(xiàn)賓格內(nèi)帶。Stang等[29]將施萬細胞與膠原I型復合物移植入坐骨神經(jīng)損傷的大鼠模型中。結果顯示，1周后發(fā)現(xiàn)導管內(nèi)有分布的神經(jīng)管；8周后有軸突產(chǎn)生，并且大鼠靶肌的張力和抗力都有一定程度的改善。

細胞外基質因保留了生物組織天然的物理結構，對軸突生長具有良好的導向性。軸突能夠在沒有施萬細胞的基底膜管道內(nèi)生長，說明基底膜支架不僅能夠作為軸突生長的基質，還能作為其再生的管道。Geuna等[30]將骨骼肌進行脫細胞處理，得到富含膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的肌膜管。在大鼠體內(nèi)植入肌膜管，能夠引導軸突再生。細胞外基質中保存的一些生長因子，也為軸突再生提供了一個良好的微環(huán)境。有研究[31]證實將神經(jīng)通過化學萃取的方法得到脫細胞的神經(jīng)基底膜管，基質中仍保存有一些粘附分子和生長因子。能夠支持軸突再生，將其應用于橋接2cm的神經(jīng)缺損，結果顯示有助于運動功能的恢復。Gu等[11]在體外加入維生素C刺激施萬細胞分泌了大量細胞外基質，其中含有豐富的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和一些生長因子。體外實驗證實細胞外基質能夠引導軸突的生長，同時運用施萬細胞源的細胞外基質，聯(lián)合神經(jīng)支架材料修復大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損，獲得了良好的修復效果。

2.3.5 其他組織器官∶在其他組織器官組織工程修復過程中，細胞外基質也得到廣泛應用。Wilson等[32]應用除垢劑聯(lián)合酶消化的方法對狗頸總動脈進行脫細胞處理，用于狗的股動脈、頸動脈和腎下主動脈的修復。結果顯示，脫細胞的頸動脈能夠實現(xiàn)較長距離的血管修復。Ota等[33]運用脫細胞的膀胱聯(lián)合肝細胞生長因子用于豬的右心室壁缺損的修復。目前許多天然的脫細胞基質產(chǎn)品，已經(jīng)經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認可，并且臨床上得到應用，收到了較為理想的修復效果。

3 展 望

隨著近年來對于細胞外基質組分和功能研究的深入，其良好生物學性能使其在組織修復重建研究中得到廣泛關注。植入宿主體內(nèi)的細胞外基質支架材料具有良好的生物降解性和較低的免疫原性，脫細胞組織的應用，一定程度上能夠改善巨噬細胞引起的炎癥反應。同時，細胞外基質中為細胞與細胞之間以及細胞與微環(huán)境間的信息交流提供了途徑，為營養(yǎng)物質向周邊細胞的傳送提供了傳輸通道。雖細胞外基質在組織工程中得到廣泛利用，仍然存在一些問題。比如去細胞方法和滅菌方法的標準化、細胞外基質中的生長因子的保存、細胞外基質獲取后的定量、投入商業(yè)化生產(chǎn)后細胞外基質中各種成分的比例配制、立體支架的設計和保存等。隨著組織工程技術和再生理論的進展，細胞外基質在動物實驗中獲得了良好的修復效果的機制被進一步闡明。運用天然細胞外基質，聯(lián)合多聚物有望成為一種理想的組織工程移植物。隨著人們對細胞外基質的不斷深入研究，細胞外基質在組織工程中的應用將會獲得更好的發(fā)展。尤其在細胞外基質修飾組織工程神經(jīng)，及特定細胞外基質修飾的組織工程皮膚、角膜、肌腱、血管、心臟、肝臟和腎臟方向上的應用性研究將會為再生醫(yī)學及組織工程的發(fā)展帶來新的技術和新的治療方法。

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Q813.1

B

國家863計劃項目（2012AA020502）；國家973計劃項目（2014CB542202），國家自然科學基金重點項目（81130080，81200932）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2012658）；江蘇省教育部基礎研究項目（12KJD180005）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）。

2014-09-10

1006-2440（2014）05-0425-06