洪珍珍 何欣 洪滔

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3及細(xì)胞周期蛋白D1在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義

洪珍珍 何欣 洪滔

目的 探討信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（stat3）及細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）對(duì)35例口腔鱗癌患者的癌組織、相應(yīng)正常組織中stat3、cyclinD1基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)正常組織的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或0．01）。鱗癌組織中stat3mRNA的表達(dá)與cyclinD1mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)（P＞0．05）。stat3、cyclinD1 mRNA的表達(dá)與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0．05），而與性別、年齡、發(fā)生部位、腫瘤大小和病理分級(jí)之間無(wú)明顯相關(guān)（均P＞0．05）。結(jié)論檢測(cè)stat3、cyclinD1mRNA的表達(dá)可能有助于口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床分期的預(yù)測(cè)；口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中stat3基因在mRNA水平上對(duì)cyclinD1的調(diào)控作用不明顯。

stat3 cyclinD1 口腔 鱗狀細(xì)胞癌 信使RNA

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（stat3）在各種腫瘤細(xì)胞和組織中激活，通過(guò)調(diào)控下游靶基因如細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）等的表達(dá)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1-2]。cyclinD1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，是G1/S期過(guò)渡的重要調(diào)控因子，可影響細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長(zhǎng)[3]。stat3通過(guò)調(diào)節(jié)cyclinD1的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生癌變。本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）對(duì)口腔鱗癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中stat3、cyclinD1基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討stat3和cyclinD1在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 選取2005-07—2012-12在我院就診并手術(shù)治療的口腔鱗癌患者35例，所有患者術(shù)前均未行放療。其中男20例，女15例，年齡39～82（57±13.4）歲；高分化鱗癌25例（I級(jí)），中、低分化鱗癌10例（Ⅰ～Ⅱ級(jí)4例、Ⅱ級(jí)2例、Ⅱ～Ⅲ級(jí)2例、Ⅲ級(jí)2例）。所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)病理確診，且腫塊手術(shù)切緣處未見(jiàn)癌組織浸潤(rùn)。取腫塊邊界外1cm處的正常黏膜上皮組織作為對(duì)照。

1.2 試劑和引物 RNA提取試劑盒（Trizol），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqDNA聚合酶均購(gòu)自上海晶美生物工程有限公司。Stat3、CyclinD1及磷酸丙糖脫氫酶（GAPDH）引物用primer3.0軟件設(shè)計(jì)，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。Stat3引物序列上游為：5′-TCT CCT ACT TCT GCT ATC TTT GAG-3′，下游為：5′-ATG GGT CTC AGA GAA CAC ATC-3′，擴(kuò)增片段為116bp；CyclinD1引物序列上游為：5′-CCA GTG ACA AAC CAT CCA GT -3′，下游為：5′-GGA TAT TCC CAA ACC ATT CC-3′，擴(kuò)增片段為371bp；內(nèi)參GAPDH引物序列上游為：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游為：5′-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為180bp。

1.3 stat3、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平測(cè)定 癌組織及癌旁正常組織切取后立即投入液氮中，轉(zhuǎn)移至-86℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎肦NA提取試劑盒從冰凍標(biāo)本提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，吸取2μl RNA樣本在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μl，stat3、cyclinD1和GAPDH在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增。Stat3擴(kuò)增條件為：94℃變性50s，56℃退火50s及72℃延伸1min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)（第6個(gè)循環(huán)末暫停，加入GAPDH引物）。CyclinD1擴(kuò)增條件為：94℃變性50s，55℃退火50s及72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（第5個(gè)循環(huán)末暫停，加入GAPDH引物）。取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外線燈下觀察攝片，掃描后在ImageMasterVDS凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行分析。每個(gè)樣本stat3、cyclinD1目的擴(kuò)增片斷吸光度（A）值與相應(yīng)的內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增片段的A值之比為stat3、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平的定量指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，stat3和cyclinD1表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析，stat3 mRNA表達(dá)與各臨床指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系采用多元線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 鱗癌組織及相應(yīng)正常組織中stat3、cyclinD1 mRNA的表達(dá)情況 鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖1-2。鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達(dá)水平分別為0.77±0.32、0.78±0.58，相應(yīng)正常組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達(dá)水平分別為0.56± 0.23、0.49±0.40，鱗癌組織中stat3及cyclinD1mRNA的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)正常組織的表達(dá)（P＜0.05或 0.01）。鱗癌組織中stat3mRNA的表達(dá)與cyclinD1mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05）。

圖1 鱗癌組織中stat3表達(dá)的電泳圖

圖2 鱗癌組織中cyclinD1表達(dá)的電泳圖

2.2 stat3、cyclinD1 mRNA的表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 stat3、cyclinD1 mRNA的表達(dá)

由表1可見(jiàn)，stat3、cyclinD1 mRNA的表達(dá)與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、發(fā)生部位、腫瘤大小和病理分級(jí)之間無(wú)明顯相關(guān)（均P＞0.05）。

3 討論

基因改變及細(xì)胞周期的調(diào)控異常是細(xì)胞癌變過(guò)程中密切相連、不可分割的兩個(gè)分子事件。細(xì)胞周期調(diào)控異常導(dǎo)致細(xì)胞的持續(xù)增殖，是腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)。已有研究表明，cyclinD1表達(dá)增高是由于基因轉(zhuǎn)錄水平的缺陷，結(jié)構(gòu)上激活的stat3能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)cyclinD1的表達(dá)。stat3激活和cyclinD1蛋白水平之間的可能聯(lián)系已于頭頸鱗癌中得到闡明[2，4-5]。頭頸鱗癌TGF-α/EGFR自分泌途徑中stat3的畸變激活，可以通過(guò)cyclinD1過(guò)表達(dá)在某種程度上促進(jìn)腫瘤的惡變。

Nagpal等[6]對(duì)口腔癌組織標(biāo)本中激活的stat3蛋白（p-stat3）表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，癌旁正常上皮組織表達(dá)p-stat3，p-stat3在T1、T2分期的腫瘤組織中高表達(dá)，而在T3、T4分期的腫瘤中表達(dá)逐漸減少，表明stat3在早期行使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活功能，隨著細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，其表達(dá)逐漸減少；RT-PCR示stat3 mRNA在T1、T2分期的腫瘤組織中高表達(dá)，T3分期減少，T4分期又增高。本研究結(jié)果顯示，stat3 mRNA在口腔鱗癌相應(yīng)正常組織中有表達(dá)，與癌組織的表達(dá)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明stat3 mRNA在口腔鱗癌形成早期即可部分行使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活功能，在腫瘤組織中這種功能更活躍。這與Napal等的研究結(jié)果一致。本研究還表明，口腔鱗癌組織stat3 mRNA表達(dá)與與性別、年齡、發(fā)生部位、腫瘤大小、病理分級(jí)等臨床指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有明顯相關(guān)性，在T1～T4分期的腫瘤組織stat3 mRNA表達(dá)水平逐漸增高，推測(cè)stat3 mRNA的表達(dá)可能有助于口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床分期的預(yù)測(cè)。

cyclinD1是參與細(xì)胞周期性G1/S轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子[3]，正常情況下它在G1期是恒定的，其過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，細(xì)胞分裂速度加快，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程和細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。cyclinD1基因目前已被證實(shí)是與腫瘤有最直接關(guān)系的癌基因[3，7-8]，在食管癌、喉癌、乳腺癌等多種腫瘤均有cyclinD1的基因擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)，且cyclinD1過(guò)表達(dá)與頭頸部腫瘤的局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，口腔鱗癌的相應(yīng)正常組織和癌組織中cyclinD1 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常組織，說(shuō)明腫瘤生殖旺盛，與其生長(zhǎng)失控的特點(diǎn)相吻合，而其相應(yīng)正常組織處于相對(duì)正常的細(xì)胞增殖狀態(tài)。鱗癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中cyclinD1過(guò)表達(dá)，加速了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，而細(xì)胞的快速分裂，導(dǎo)致腫瘤形成。

本文結(jié)果還顯示，stat3 mRNA與cyclinD1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)，推測(cè)口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中stat3基因在mRNA水平上對(duì)cyclinD1的調(diào)控作用不明顯。由于本研究從mRNA水平研究發(fā)現(xiàn)stat3對(duì)cyclinD1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)并未發(fā)生變化，而已有的研究證實(shí)癌變過(guò)程中發(fā)揮作用的是p-stat3，故口腔鱗癌中stat3激活提高轉(zhuǎn)錄水平和cyclinD1上調(diào)之間的關(guān)系尚有待進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強(qiáng)調(diào)來(lái)源，（3）遺傳背景，（4）微生物學(xué)質(zhì)量，（5）明確等級(jí)，（6）明確飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，（7）明確性別，（8）有無(wú)質(zhì)量合格證，（9）有對(duì)飼養(yǎng)的描述（如飼料型、營(yíng)養(yǎng)水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動(dòng)物數(shù)量準(zhǔn)確，（11）詳細(xì)描述動(dòng)物的健康狀況，（12）對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的處理方式有單獨(dú)清楚的交代，（13）全部有對(duì)照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Expression of stat3/cyclinD1 pathway in oral squamous cell carcinoma and its significance

Objective To determine the expression and clinical significance of stat3/cyclinD1 pathway in oral squamous cell carcinoma(OSCC)．MethodsTissue specimens of carcinoma and matched normal mucosa were taken from 35 patients with OSCC．The mRNA expression of stat3 and cyclinD1 in tissue specimens were determined by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)．ResultsThe mRNA expression of stat3 and cyclinD1 gene in OSCC were significantly higher than that in normal mucosa(P＜0．05)．The expression of stat3 and cyclinD1 mRNA in OSCC was correlated with lymph node metastasis and clinical stages of tumor(P＜0．05),while was not correlated with sex,age,tumor location,tumor size and pathological grade (P＞0．05)．There was no correlation between expression of stat3 and cyclinD1 mRNA in OSCC tissue specimens (P＞0．05)．ConclusionDetermination of stat3 and cyclinD1 gene expression may contribute to predict lymph node metastasis and clinical stage of oral squaremous cell carcinoma．The results indicate that stat3 gene may not involve in regulation of cyclinD1 expression in the development of OSCC．

stat3 cyclinD1 Mouth Squamous cell Carcinoma mRNA

2013-11-08）

310003 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院口腔科

洪滔，E-mail：htown@163.com