黃旭晴 施長春 李旭 陳剛

曲古抑菌素A對博萊霉素致肺纖維化小鼠新生血管的影響

黃旭晴 施長春 李旭 陳剛

目的 探討組蛋白脫乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）對博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的新生血管的影響。方法120只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為控制對照組（CG）、肺纖維化模型組（MG）、TSA早期處理組（EG）和TSA晚期處理組（LG）。MG、EG、LG予以博萊霉素溶液10mg/kg氣管內(nèi)注射建立小鼠肺纖維化模型，CG予以等體積0．9%氯化鈉溶液注射。TSA處理組在造模后分兩個(gè)階段（早期：第1～14天；晚期：第15～28天）予以TSA溶液40 mg/kg腹腔內(nèi)注射，每周2次；CG和MG則予以等體積二甲基亞砜（Dmso）腹腔注射。各組于造模后第7、14、28天分三批處死，觀察肺組織大體，行HE和Masson染色，Szapiel評分，測定羥脯氨酸（HYP）含量，免疫組化檢測血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial groth factor，VEGF）。結(jié)果小鼠造模均成功：CG小鼠未見藍(lán)色膠原沉積；MG小鼠可見藍(lán)色膠原沉積明顯；并隨著小鼠生存時(shí)間延長，藍(lán)色膠原沉積加重，EG小鼠可見藍(lán)色膠原沉積介于CG組與MG組之間；LG組藍(lán)色膠原沉積較EG更重。與CG組比較，其他各組各時(shí)點(diǎn)HYP含量及VEGF的IOD值均發(fā)生顯著變化（均P＜0．01）；與MG組比較，EG組第7、14、28天HYP含量均顯著降低（均P＜0．01）；與EG組比較，LG組第7、14、28天HYP含量均顯著升高（均P＜0．01）。與MG組比較，EG組第7、14、28天VEGF的IOD值均發(fā)生顯著變化（均P＜0．01）；與EG組比較，LG組第7、14、28天VEGF的IOD值均顯著升高（均P＜0．01）。結(jié)論早期予以TSA可以抑制博萊霉素致肺纖維化小鼠新生血管形成，減輕肺間質(zhì)纖維化，晚期干預(yù)則沒有明顯作用。

組蛋白脫乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 肺間質(zhì)纖維化 新生血管

目前，肺纖維化仍存在發(fā)病機(jī)制不清，表現(xiàn)復(fù)雜，治療效果不理想等問題。特發(fā)性肺纖維化為慢性進(jìn)行性發(fā)展的致死性疾病，預(yù)后差，中位生存期為2～2.8年，糖皮質(zhì)激素/和免疫抑制劑等常規(guī)治療措施有效率不足30%[1]，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，拓展新的治療措施具有重要意義。研究證實(shí)，新生血管形成在肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用[2]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是強(qiáng)烈而高度特異性的血管內(nèi)皮有絲分裂原，在新生血管形成中起重要作用，其表達(dá)與新生血管形成呈正相關(guān)。VEGF可能通過與特異性受體結(jié)合促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步導(dǎo)致肺纖維化[3]。VEGF信號途徑在新生血管形成居于主要地位[4]。曲古抑菌素A（TSA）為鏈霉菌代謝產(chǎn)物，是一種組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑。TSA已被報(bào)道可以抑制低氧或VEGF誘導(dǎo)的新生血管形成[5-6]。本研究以博萊霉素（bleomycin，月LM）致肺纖維化小鼠模型[7-8]為實(shí)驗(yàn)對象，旨在探討TSA對月LM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的新生血管的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級C57月L/6小鼠120只，6～8周齡，體重18～22g；購于南京君科生物工程有限公司。試劑：羥脯氨酸（HYP）檢測試劑盒購于南京建成生物研究所，TSA購自Sigma公司，月LM購自哈爾濱博萊制藥有限公司，VEGF試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與造模 將小鼠隨機(jī)法分為4組，每組30只。CG組：第1天氣管內(nèi)注入0.9%氯化鈉溶液0.15ml；MG組：第1天氣管內(nèi)注入10mg/kg月LM及腹腔注射0.9%氯化鈉溶液15ml；EG組：氣管內(nèi)第1天注入月LM及第1～14天腹腔注射TSA（40mg/kg）；（4）LG：第1天腹腔注入月LM劑量及第15～28天腹腔注射TSA（40mg/ kg）。實(shí)驗(yàn)小鼠頸正中切口、鈍性分離淺筋膜逐層暴露氣管；MG、EG及LG組小鼠每只按5mg/kg一次性快速氣管內(nèi)注入月LM 0.15ml，CG組小鼠每只氣管內(nèi)注入0.9%氯化鈉溶液0.15ml；直立、輕輕、快速地旋轉(zhuǎn)動(dòng)物約2min，使藥物盡可能均勻分布于氣管、支氣管和雙肺。局部酒精消毒，縫合傷口。EG及LG組小鼠在造模后分兩個(gè)階段（早期：第1～14天；晚期：第15～28天）予以TSA（40mg/kg）腹腔內(nèi)注射（2次/周）作為治療干預(yù)；CG和MG組小鼠同時(shí)間點(diǎn)予以等體積二甲基亞砜（DMSO）腹腔內(nèi)注射作為對照。

1.3 檢測方法

1.3.1 肺組織HE和masson染色 在光鏡下觀察小鼠肺組織大體，Masson染色進(jìn)行膠原纖維及肌纖維的鑒別，以此確定建模是否成功。

1.3.2 肺泡炎及肺纖維化程度評定 采用Szapiel等[9]報(bào)道的方法評定，將肺纖維化分為（-）～（+++）級：（-）級：正常肺組織，無纖維化，評0分；（+）級：輕度纖維化，受累面積＜20%，纖維化累及胸膜、胸膜下肺間質(zhì)，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，評1分；（++）級：中度纖維化，病變范圍約占全肺20%～50%，肺纖維化區(qū)域從胸膜開始延伸，但仍屬局部性，評2分；（+++）級：重度纖維化，病變范圍＞50%，并有融合，可見大小不等的囊氣腔，并伴有廣泛肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，評3分。

1.3.3 肺組織勻漿HYP檢查 準(zhǔn)確稱取保存?zhèn)溆玫臐穹谓M織30～40mg/只，剪碎后制成勻漿，采用鹼水解法測定樣本光密度，然后根據(jù)光密度和肺組織重量計(jì)算HYP含量，具體操作嚴(yán)格試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 VEGF測定 采用免疫組化SP法，切片皆采用圖像分析軟件先進(jìn)行顏色分離，然后自動(dòng)計(jì)算其光密度（IOD）值進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠肺組織肉眼觀病理變化比較 CG組小鼠正常肺組織彈性回縮良好，呈粉紅色，濕潤、表面光滑；MG組小鼠第7天時(shí)雙肺呈暗紅色病灶中可見較多點(diǎn)狀，第14天時(shí)雙肺出現(xiàn)較多片狀白色區(qū)域，肺容積開始降低，第28天時(shí)肺組織呈蒼白色澤，肺體積明顯縮小，硬度增加，彈性降低，仍舊可見散在的細(xì)小出血點(diǎn)，表面凹凸不平，彈性明顯降低；EG組小鼠第28天時(shí)肺部濕潤、有彈性、表面光滑，體積縮小不明顯，彈性尚好，表面輕微結(jié)節(jié)樣改變；LG組小鼠第28天時(shí)病變與MG組小鼠相似。

2.2 4組小鼠肺組織顯微鏡下病理形態(tài)比較 MG組小鼠第7天肺泡腔、肺間質(zhì)內(nèi)有大量的多核及單核細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為肺泡炎及肺間質(zhì)炎癥，可見大量新生血管形成，第14天時(shí)損傷改變分布不均勻，以胸膜下區(qū)明顯，肺泡間隔輕度增寬、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤明顯、膠原纖維沉積少，第28天時(shí)肺組織肺泡炎仍較重，并開始出現(xiàn)纖維化改變，新生血管減少，破壞嚴(yán)重、纖維化明顯、少見炎性細(xì)胞浸潤。與MG組比較，EG組小鼠第7、14、28天時(shí)炎癥和纖維化均不明顯；LG組小鼠相關(guān)指標(biāo)無明顯改善，第7、14天時(shí)仍出現(xiàn)明顯巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤和纖維化改變，第28天時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯、炎性細(xì)胞浸潤減少，而間質(zhì)大量膠原沉積。

2.3 Masson染色結(jié)果 小鼠造模均成功：CG小鼠未見藍(lán)色膠原沉積；MG小鼠可見藍(lán)色膠原沉積明顯；并隨著小鼠生存時(shí)間延長，藍(lán)色膠原沉積加重，EG小鼠可見藍(lán)色膠原沉積介于CG組與MG組之間；LG組藍(lán)色膠原沉積較EG更重（圖1-3）。

2.4 4組小鼠肺組織HYP含量的比較 見表1。

由表1可見，與CG組比較，其他各組各時(shí)點(diǎn)HYP含量均發(fā)生顯著變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與MG組比較，EG組第7、14、28天HYP含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與EG組比較，LG組第7、14、28天HYP含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖1 各組第7天肺組織情況（A：CG組，B：MG組，C：EG組，D：LG組；Masson染色，×400，下同）

圖2 各組第14天肺組織情況（A：CG組，B：MG組，C：EG組，D：LG組）

圖3 各組第28天肺組織情況（A：CG組，B：MG組，C：EG組，D：LG組）

表1 4組小鼠肺組織HYP含量的比較（μg/mg）

表2 4組小鼠VEGF的IOD值比較（×103）

2.5 4組小鼠VEGF的IOD值比較 見表2。

由表2可見，與CG組比較，其他各組各時(shí)點(diǎn)VEGF的IOD值均發(fā)生顯著變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與MG組比較，EG組第7、14、28天VEGF的IOD值均發(fā)生顯著變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.01）；與EG組比較，LG組第7、14、28天VEGF的IOD值均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

HDAC抑制劑可以通過抑制組蛋白去乙?；?，從而阻斷由于募集功能紊亂而導(dǎo)致的基因表達(dá)受抑進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)[10]。在小鼠模型中，Hop（HDAC相關(guān)的核蛋白）過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，而HDACI則可以逆轉(zhuǎn)這一過程[11]。HDAC抑制劑TSA通過分子靶向作用減少組蛋白的乙?；潭龋瑥亩淖兘M蛋白乙?；氖Ш鉅顟B(tài)所引起的基因調(diào)控失衡達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)[12]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長阻滯、分化和凋亡。有研究顯示，TSA可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]。

TSA主要用于抑制腫瘤新生血管形成，未見有關(guān)肺纖維化的報(bào)道。從臨床過程和病理學(xué)改變看，博萊霉素所致肺纖維化（月PF）與特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化非常相似[7-8]。在月PF過程中，肺組織HYP含量進(jìn)行性增加。HYP的生成對維持膠原的穩(wěn)定及前膠原的分泌具有重要作用，未羥化的前膠原鏈在細(xì)胞內(nèi)被降解；如果過度羥化，HYP含量過多，使膠原穩(wěn)定性增加、分解減少，可導(dǎo)致組織纖維化[15]。早期給予TSA處理后羥脯氨酸含量顯著降低，說明早期給予TSA處理減少了膠原中脯氨酸羥化，促進(jìn)了膠原降解，抑制了肺纖維化發(fā)生。

新生血管形成在肺纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[2]。研究證實(shí)，TSA可以抑制低氧或VEGF誘導(dǎo)的新生血管形成[5-6]。在肺損傷后氣道上皮等釋放過多VEGF，促進(jìn)黏附和肺組織的新生血管形成。大量新生血管為成纖維細(xì)胞提供營養(yǎng)，新生血管形成可促纖維化形成，反過來抑制新生血管形成可以減緩肺纖維化進(jìn)程。通過檢測VEGF的表達(dá)可以判斷肺纖維化的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EG組VEGF表達(dá)較MG組減少，較CG組增多，說明肺纖維化程度與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，月LM損傷肺早期可見肺間質(zhì)內(nèi)先是巨噬細(xì)胞隨后彌漫性間質(zhì)強(qiáng)烈表達(dá)VEGF并伴有肺間質(zhì)大量新生血管形成[16]。新生血管形成可以促進(jìn)肺纖維化形成，反過來抑制新生血管形成可以減緩肺纖維化進(jìn)程。TSA通過阻斷VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的營養(yǎng)、增殖和促進(jìn)存活作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制新生血管形成。

綜上所述，早期給予TSA阻斷VEGF/VEGFR信號途徑，抑制巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞黏附、活化和降低血管通透性等途徑，抑制新生血管形成減輕肺損傷和月PF。后期主要是纖維增生階段，無明顯的炎癥反應(yīng)和炎性細(xì)胞浸潤，VEGF表達(dá)水平也不高，TSA治療效果不明顯。今后還可在TSA對月PF新生血管形成的CD31抑制方面進(jìn)一步研究。

[1]American Thoracic Society(ATS),and the European Respiratory Society (ERS)．Idiopathic pulmonary fibrosis:diagnosis and treatment,International consensus statement[J]．Am J Respir Crit Care Med,2000,161:646-664．

[2]Okuma T,Terasaki Y,Kaikita K,et al．C-C chemokine receptor-2 (CCR2)deficiency improves bleomycin-induced pulmonary fibrosis by attenuation of both macrophage infiltration and production of macrophage-derived matrix metalloproteinases[J]．J Pathol,2004,204:594-604．

[3]Chen H W,Lacombe L,Montgomery K,et al．HATs on and beyond Chromatin[J]．Current opinion in cell biology Opinion in Cell Biology,2001,13:218．

[4]Ferrara N．Vascular endothelial growth factor[J]．Trends Cardiovasc Med,1993,3:244-250．

[5]Kim M S,Kwon H J,Lee Y M,et al．Histone deacetylases induce an-giogenesis by negative regulation of tumor suppressor genes[J]．Nat Med,2001,7:437-443．

[6]Deroanne C F,Bonjean K,Servotte S,et al．Histone deacetylases inhibitors as anti-angiogenic agents altering vascular endothelial growth factor signaling[J]．Oncogene,2002,21,427-436．

[7]Maheshwari U,Gupta D,Aggarwal A N,et al．Spectrum and diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis[J]．Indian J Chest Dis Allied Sci,2004,46:23-26．

[8]Davies H R,Richeldi L．Idiopathic pulmonary fibrosis:current and future treatment options[J]．Am J Respir Med,2002,1:211-224．

[9]Szapiel S V,Elson N A,Fulmer J D．Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude athymic mouse[J]．Am Rev Respir Dis,1979,120:893-899

[10]Marks P A,Miller T,Richon V M．Histone deacetylases[J]．Curr Opin Pharmacol,2003,3(4):344-351．

[11]Kook H,Lepore J J,Gitler A D,et al．Cardiac hypertrophy and histone deacetylase-dependent transcriptional repression mediated by the atypical homeodomain protein Hop[J]．J Clin Invest, 2003,112:863-871．

[12]Kouzarides T．Histone acetylase and deacetylase in cell proliferation[J]．Curr Opin Genet Dev,1999,9(1):40-48．

[13]Yang H,Nie Y,Li Y,et al．Histoue modification mediated CYP2-E1 gene expression and apoptosis of HepG2 cells[J]．Exp Bio Med(Maywood),2010,235(1):32-39．

[14]Rahman R,Osteso-lbanez T,Hirst R A,et al．Histone deacetylase inhibition attenuates cell growth with associated telomerase inhibition in high-grade childhood brain tumor cells[J]．Mol Cancer Ther,2010,9(9):2568-2581．

[15]劉秉文,陳俊杰．醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)[M]．2版．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2005:67-84．

[16]Sewack G F,Elis T W,Hansen U．Binding of TATA binding protein to a naturally positioned nucleosome is facilitated by histone acetylation[J]．Mol Cell Biol,2001,21:1404-1415．

Effect of trichostatin A on lung angiogenesis in mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis

Objective To investigate the effects of histone deacetylase inhibitor(HDACI）trichostatin A(TSA)on lung angiogenesis in mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis．MethodsOne hundred and twenty C57BL/6 mice were randomly divided into four groups(n=30 in each group)．Pulmonary fibrosis was induced by intratracheal injection of bleomycin 10mg in MG,EG and LG groups．Intraparitoneal injection of TSA was given 2/w to mice in EG(d1-d14)and LG(d15-28)groups;and same volume of dimethyl sulfoxide(DMSO)was given to mice in CG and MG groups．Mice were sacrificed in batches at d7,14 and 28,the lung tissue specimens were stained with HE and Masson method and the fibrosis was evaluated with Szapiel score．The hydroxyproline(HYP)level was measured and VEGF was detected by immunohistochemistry．ResultsThe HYP contents and the expression of VEGF in MG and LG were significant higher than those in CG;while the HYP level and the VEGF expression in EG were lower than those in MG and LG．ConclusionResults indicate that early administration of TSA in mice with bleomycin induction can attenuate the pulmonary fibrosis via inhibiting angiogenesis，however,delayed administration of TSA has no significant effect．

Histone deacetylase inhibitor(HDACI) Pulmonary interstitial fibrosis Angiogenesis

2013-05-13）

（本文編輯：歐陽卿）

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃A類項(xiàng)目（2011A017）

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科

施長春，E-mail：shicc1961@163.com