徐志波 王璐 陳斌 何薇 胡敬獻 劉賢忠 陳芳

●論 著

保肺定喘湯對COPD全身炎癥反應及脂質(zhì)代謝影響的實驗研究

徐志波 王璐 陳斌 何薇 胡敬獻 劉賢忠 陳芳

目的 探討保肺定喘湯對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）全身炎癥反應及脂質(zhì)代謝的影響。 方法 將40只SD大鼠隨機分為4組：正常組10只、吸煙組30只（其中保肺定喘湯預防組10只、保肺定喘湯治療組10只、COPD組10只）。除正常組外，其余3組大鼠在自制熏煙箱內(nèi)被動吸煙24周，并于第30天和第45天于氣道內(nèi)滴入脂多糖。預防組開始吸煙時每天即予2ml保肺定喘湯灌胃，而治療組在COPD出現(xiàn)后開始以同等體積保肺定喘湯灌胃治療4周。實驗結(jié)束后處死大鼠，檢測血清瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素、甘油三酯等指標，肺組織標本行HE病理染色檢查。 結(jié)果 COPD組瘦素、脂聯(lián)素、甘油三酯等均比保肺定喘湯預防組及治療組減少，均有統(tǒng)計學差異（均P＜0．05）；而TNF-α則顯著高于保肺定喘湯預防組及治療組（均P＜0．01）；瘦素與TNF-α、脂聯(lián)素、甘油三酯呈負相關（r=-0．685、-0．652、-0．633，均P＜0．05）。 結(jié)論 保肺定喘湯能夠改善COPD全身慢性炎癥反應及脂質(zhì)代謝。

慢性阻塞性肺疾病 瘦素 脂聯(lián)素 全身炎癥反應 脂質(zhì)代謝

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），是呼吸系統(tǒng)的常見疾病，以持續(xù)存在的氣流受限為特征，氣流受限常呈進行性發(fā)展。人們目前已經(jīng)認識到COPD屬于全身炎癥性疾病，炎癥的持續(xù)存在可造成COPD慢性進行性發(fā)展。因介導COPD發(fā)生、發(fā)展的炎癥介質(zhì)種類繁多，目前尚未被充分認識，即使接受藥物和單純戒煙治療，患者肺部炎癥仍然存在。保肺定喘湯是浙江省中醫(yī)院國家級名中醫(yī)王會仍教授的經(jīng)驗方，從整體觀念出發(fā)進行調(diào)治，在臨床應用于COPD患者具有良好的療效。本實驗通過此方對吸煙誘導的COPD進行實驗干預，探討其在對抗COPD全身炎癥反應及改善脂質(zhì)代謝方面的獨特療效。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 成年清潔級SD大鼠40只，均為雄性，體重（217±13）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，每籠5只飼養(yǎng)，控制室溫（20±2）℃，濕度40%～70%，12h交替采光，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食。

1.2 實驗用藥 采用國家級名老中醫(yī)王會仍主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗方——保肺定喘湯（由黃芪、黨參、當歸、丹參、熟地、麥冬、地龍、桔梗、仙靈脾、甘草等組成）。由浙江中醫(yī)藥大學制劑室按正規(guī)程序制備成流浸膏（含生藥3.1g/ml），再以0.9%氯化鈉溶液按1.2∶0.8的比例配成2ml保肺定喘湯稀釋品。實驗用煙為雄獅牌過濾嘴香煙（浙江中煙工業(yè)有限責任公司出品，焦油量8mg，煙氣煙堿量0.7mg）。

1.3 試劑 脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素、甘油三酯、VLDL酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒均購自武漢新啟迪生物科技有限公司。甲醇、水合氯醛等常規(guī)試劑購置于華東醫(yī)藥集團有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及造模方法 40只SD大鼠依隨機數(shù)字表法分成正常組10只，吸煙組30只（其中保肺定喘湯預防組10只、保肺定喘湯治療組10只、COPD組10只）。本研究采用并改進了張金梅等[1]的造模方法，保肺定喘湯預防組、治療組和COPD組大鼠每天均在自制熏煙箱里吸煙2h（上、下午各1h），維持煙箱內(nèi)煙霧濃度450～500bpm。在造模第30天、第45天分別于吸煙組大鼠氣道滴入LPS 0.2ml，滴入LPS當天不吸煙，共吸煙24周。預防組在造模開始時即每天上午予2ml保肺定喘湯灌胃1次共24周，治療組則每天上午予2ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃1次直至第20周，然后調(diào)整為保肺定喘湯2ml灌胃1次/d共4周。正常組與吸煙組飼養(yǎng)環(huán)境相同，但不吸煙，不灌胃。最后依據(jù)肺組織HE染色病理切片判斷COPD造模是否成功。

1.4.2 標本采集 大鼠吸煙24周，常規(guī)稱重后予10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔內(nèi)注射麻醉，腹主動脈取血5ml，置于預冷的負壓真空采血管中，靜置30min后，于離心機中以2 000r/min，4℃離心10min，收集上清液分裝至-70℃冰箱中保存；大鼠處死后開胸分離肺組織，迅速浸潤于10%中性甲醛溶液中固定。

1.4.3 肺組織病理切片制作 將甲醛溶液固定24h的肺組織，按病理切片制作方法，常規(guī)取材脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，中性樹膠封片，并在顯微鏡100倍視野下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化，包括炎癥細胞浸潤、管壁纖維增生程度及管腔變形狹窄等并拍照。

1.4.4 大鼠血清瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素、甘油三酯、VLDL測定 取出冷凍的血標本常溫解凍后，于超凈臺上以ELISA法進行各組血清瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素、甘油三酯、VLDL的測定，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，符合正態(tài)性和方差齊性的多組計量資料組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果 大鼠肺組織病理切片結(jié)果示正常組肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡間隔清晰，氣道管壁無纖維增生，管腔無變形狹窄，內(nèi)無黏液附著，基本無炎癥細胞浸潤；而COPD組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯破壞，氣道管壁纖維增生，管腔嚴重變形狹窄，大量黏液阻塞管腔，炎癥細胞彌漫浸潤；保肺定喘湯治療組肺組織結(jié)構(gòu)雖有破壞，氣道管壁雖有纖維組織增生，且有炎癥細胞浸潤，但都較COPD組有改善，特別是其氣道管腔尚規(guī)則。保肺定喘湯預防組則表現(xiàn)出比治療組更好的效果，見圖1。

圖1各組大鼠肺組織病理結(jié)果（A：正常組；B：預防組；C：治療組；D：COPD組；HE染色，×100）

2.2 各組大鼠血清瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素表達水平 COPD組大鼠血清瘦素水平低于其他3組，且均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），其中正常組、治療組間比較也有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），而預防組與治療組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。COPD組大鼠血清TNF-α水平高于其余3組，均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.01），治療組與正常組大鼠血清TNF-α亦有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），而預防組與正常組以及治療組與預防組大鼠之間血清TNF-α比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。COPD組大鼠血清脂聯(lián)素水平低于其余3組，均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），而正常組、預防組、治療組各組間兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素檢測結(jié)果（ng/ml）

2.3 各組大鼠血清甘油三酯、VLDL表達水平 COPD組大鼠血清甘油三酯水平 [（0.497±0.086）mmol/L]明顯低于正常組[（0.724±0.108）mmol/L]、預防組[（0.680± 0.109）mmol/L]和治療組[（0.655±0.123）mmol/L]，且均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.01），而正常組、預防組、治療組血清甘油三酯水平兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。COPD組大鼠血清VLDL水平[（0.222±0.029）mmol/L]低于正常組 [（0.262±0.023）mmol/L]、預防組 [（0.250± 0.017）mmol/L]，比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），而COPD組與治療組[（0.242±0.019）mmol/L]以及正常組與預防組大鼠血清VLDL水平比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

2.4 大鼠各指標間相關性分析 綜合分析COPD組大鼠各指標數(shù)據(jù)，其瘦素水平與TNF-α、脂聯(lián)素、甘油三酯的水平呈線性負相關（r=-0.685、-0.652、-0.633，均P＜0.05），TNF-α與甘油三酯水平亦呈線性負相關（r=-0.714，P＜0.05）；而瘦素、TNF-α與VLDL無相關性（r=-0.506、0.347，均P＞0.05）。

3 討論

越來越多的實驗結(jié)果顯示COPD是一種全身慢性炎癥疾病，多種炎癥因子的持續(xù)存在和復雜作用，是造成呼吸道炎癥難以控制，導致氣管損傷與抗損傷反復出現(xiàn)，氣管重塑明顯，氣流受限進行性發(fā)展的最終原因。而且持續(xù)存在的炎癥反應，亦可引起嚴重的肺外不良反應，如體重下降，營養(yǎng)不良，骨質(zhì)疏松等，進而加劇病情，增加患者病死率[2]。故總體上講，COPD可以認為是炎癥因子介導的以肺部受損為主的綜合性疾病。筆者采用中醫(yī)藥從整體觀念上治療COPD的全身炎癥反應，臨床上已證實可減少COPD患者的急性發(fā)作次數(shù)和住院率，提高患者的免疫功能。

保肺定喘湯由黨參、黃芪、丹參、當歸、熟地、麥冬、廣地龍、仙靈脾、桔梗、甘草這十味中藥組成。方中以黃芪、黨參為君。前者甘溫，善入脾胃，為補中益氣之要藥；后者性味甘平，善健運中氣，潤肺生津。兩藥配伍，相須為用，大補脾肺之氣。熟地甘微溫，入肝腎而功專養(yǎng)血滋陰，填精益髓，為養(yǎng)血補虛之要藥。當歸甘辛溫，長于補血和血，為補血之圣藥。麥冬味甘柔潤，長于養(yǎng)陰生津。這三味藥同為甘潤之品，合用善滋養(yǎng)肺腎之陰血，再配伍辛甘之仙靈脾，兼顧陰陽，共為臣藥?！耙晃兜ⅲν奈铩?，丹參性微寒而緩，善祛瘀生新，配合搜風走竄之蟲類藥地龍，有通行剔絡之效。此外，丹參、當歸配伍黃芪、當歸等補氣活血藥，正符合“氣虛血瘀”之本。桔梗辛散苦泄，為肺部之引經(jīng)，其與甘草合用，乃仲景桔梗湯，善利咽止咳，配合“主咳逆上氣”之當歸，宣肺、利咽、止咳之效更加，為佐藥。甘草味甘，善入中焦，能“助參芪成氣虛之功”。諸藥配伍，能較好的補益脾肺腎三臟，并能兼顧痰、瘀等病理產(chǎn)物，這十分符合COPD“脾肺腎虧虛”的本和“痰、瘀”等病理產(chǎn)物阻滯的標，即肺氣不利、痰瘀互結(jié)，從而引起氣流阻塞、氣道增厚、微循環(huán)紊亂，這與現(xiàn)代醫(yī)學的氣流受限、血管新生、氣道重塑的理念不謀而合。

瘦素和脂聯(lián)素均由脂肪組織分泌，已有實驗證實瘦素是目前肯定的與COPD有明顯相關性的細胞因子之一，不僅參與了機體能量代謝的調(diào)節(jié)及脂肪合成，同時還是機體重要的促炎因子[3]，能夠選擇性增強吞噬細胞對TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌[4]，與氣道炎癥性疾病的發(fā)生有著密切的關系。Bellmeyer等[5]認為于野生型鼠氣道內(nèi)滴入瘦素會引起炎性細胞因子表達增加；而脂聯(lián)素則具有增強胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[6]。TNF-α作為一種重要的炎癥性因子，對COPD的發(fā)生、發(fā)展均有重要作用，眾多實驗證實COPD患者血清中的TNF-α較正常人明顯增高，且TNF-α可誘導惡病質(zhì)發(fā)生，是最早被證明與惡病質(zhì)有關的細胞因子。本實驗結(jié)果提示COPD組大鼠瘦素與TNF-α及脂聯(lián)素均為負相關，且血清脂質(zhì)水平也較其他3組降低明顯，可能機制為：（1）香煙煙霧中有害成分（尼古丁、焦油等）刺激肺泡巨噬細胞浸潤活化并釋放大量的炎性因子引起脂肪分解消耗增加，瘦素、脂聯(lián)素分泌減少；（2）循環(huán)中增多的TNF-α，一方面增加脂肪的分解消耗[7]，另一方面又可以刺激脂肪組織合成瘦素增多，而瘦素本身既有促炎癥作用，兩者形成一個正反饋，造成炎癥反復存在；（3）大量吸煙可引起大鼠應激反應增加，從而分泌兒茶酚胺增多，其又可增加脂肪的分解消耗。綜上即可解釋COPD組瘦素水平反而較其他組降低的原因。而同等造模條件下，給予保肺定喘湯預防或治療后，大鼠瘦素、TNF-α、脂聯(lián)素均較COPD組有明顯的改善，尤以對TNF-α的治療作用突出。說明保肺定喘湯對吸煙誘導的COPD具有抗炎、控炎、抑制脂肪分解及提高免疫力等作用，其具體機制可能是通過控制上述原因而進一步起作用的。

綜上所述，保肺定喘湯能夠有效地改善COPD患者全身慢性炎癥反應，對處于穩(wěn)定期的COPD患者減少急性發(fā)作次數(shù)可能有重要意義，但其具體作用機制仍需進一步研究明確。

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Protective effects of Chinese herbal medicine Baofeidingchuan decoction on systemic inflammation and lipid metabolism in COPD rats

ObjectiveTo investigate the effects of Baofeidingchuan decoction on systemic inflammation and lipid metabolism in rats with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．Methods Rat COPD model was induced by passive smoking for 24 weeks and dropping lipopolysaccharides into airway at d 30 and d 45．Rats in prevention group(n=10)were given 2ml Baofeidingchuan decoction by gavage before COPD induced and rats in treatment group(n=10)were given same volume of Baofeidingchuan decoction after COPD induced for 4 weeks．Rats in normal control(n=10)and in COPD model groups(n=10) were given 2ml normal saline by gavage for 4 weeks．At the end of experiments all rats were sacrificed,serum levels of leptin, adiponectin,triglycerides were measured and pathological examination of lung tissue was performed．Results Serum levels of leptin,adiponectin,triglycerides in COPD group were lower than those in prevention and treatment groups(all P＜0．05）,while serum TNF-α level in COPD group were significantly higher than that in prevention and treatment groups．Serum leptin levels were negatively correlated with TNF-α,adiponectin and triglycerides levels(r=-0．685,-0．652 and-0．633,allP＜0．05)．Conclusion Baofeidingchuan decoction can improve chronic systemic inflammation and lipid metabolism in rats with chronic obstructive pulmonary disease．

Chronic obstructive pulmonary disease Leptin Adiponectin Systemic inflammatory response Lipid metabolism

2014-03-10）

（本文編輯：胥昀）

國家自然基金項目（2012R10063）；浙江省中醫(yī)藥管理局項目（2011ZQ009）

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（徐志波、王璐、何薇、胡敬獻、劉賢忠）；浙江省中醫(yī)院肺功能室（陳斌、陳芳）

兼共同第一作者：陳芳，E-mail:funchen@163.com