王勇　卜勁松

耐青霉素肺炎鏈球菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

王勇卜勁松

【摘要】目的觀察耐青霉素肺炎鏈球菌異常蛋白表達(dá)，探討其蛋白組學(xué)差異與耐青霉素的關(guān)系。方法采用次抑菌濃度法將肺炎鏈球菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株誘導(dǎo)為耐青霉素肺炎鏈球菌株；雙向電泳分離肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和誘導(dǎo)耐藥株的全菌蛋白質(zhì)；Image Master 2D Platinum 5.0軟件對電泳圖譜進(jìn)行分析，尋找表達(dá)差異蛋白點；對差異蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果成功誘導(dǎo)耐青霉素肺炎鏈球菌，并建立肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株的全菌蛋白雙向電泳圖譜。標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株分別分離出約320，350個蛋白點，發(fā)現(xiàn)10個差異蛋白。與標(biāo)準(zhǔn)株比較，ABC轉(zhuǎn)運器、觸發(fā)因子、DNA聚合酶Ⅲ、氨基酸ABC轉(zhuǎn)運和SP表面蛋白A表達(dá)量上調(diào)，分子伴侶、脂蛋白、果糖二磷酸醛縮酶、α-烯醇化酶和假想蛋白表達(dá)量下調(diào)。結(jié)論耐青霉素肺炎鏈球菌蛋白表達(dá)異常導(dǎo)致的蛋白組學(xué)改變可為深入探討其耐藥機(jī)制提供新的研究方向。

【關(guān)鍵詞 】耐青霉素肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳質(zhì)譜分析

肺炎鏈球菌（streptococous pneumoniae,SP）是一種較為常見的革蘭陽性鏈球菌,是引起兒童及成人細(xì)菌性肺炎的主要致病菌[1]。長期以來，青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素是治療SP感染的首選抗生素。近年來，隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，造成SP頻繁發(fā)生變異，產(chǎn)生耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）菌株，且耐藥率高、耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣，給SP的防治帶來新的挑戰(zhàn)[2]。鑒于此，筆者通過對PRSP的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以探討蛋白組學(xué)差異與SP耐青霉素的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1菌株來源SP國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619，購自中國藥品生物制品鑒定所；PRSP：使用SP國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619，采用次抑菌濃度(1/2MIC)誘導(dǎo)耐藥方法[3]，建立耐藥菌株。

1.2儀器與試劑苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品鑒定所）。IPGphor等電聚焦電泳儀、Ettan DALTⅡ垂直電泳儀（Amersham Pharmacia Biotech，美國）。IPG干膠條（pH4-7線性13cm）和IPG Buffer（pH4-7）（Amersham Biosciences，瑞典）、丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、三氯乙酸、低熔點瓊脂糖、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、CHAPS、硫脲及考馬斯亮藍(lán)R-250（Amresco，美國）、四甲基乙二胺、尿素、碘乙酰胺、乙腈（Sigma，美國）。

1.3方法

1.3.1蛋白質(zhì)雙向電泳和染色[4]采用超聲兼Urea-Thiourea-CHAPS-DTT裂解提取法提取蛋白質(zhì)，應(yīng)用BradFord法對提取的可溶性總蛋白定量后進(jìn)行第一相固相pH梯度等電聚焦，程序分別為30V 2h，100V 2h，200V 1h，500V 1h，1 000V 1h，3 000V 5h，8 000V 3h，8 000V 8.5h。平衡后進(jìn)行第二相垂直板 SDSPAGE電泳，以考馬斯亮藍(lán)染色按Neuhoff等的方法進(jìn)行染色。

1.3.2圖像處理用AmershamBioscience掃描儀進(jìn)行投射掃描（分辨率為500dpi）；數(shù)字化圖像文件運用Image Master 2D Platinum軟件分析；蛋白質(zhì)斑點經(jīng)自動檢測后進(jìn)行手工校對，匹配之前先選一塊膠作為參考凝膠，其他凝膠都與之匹配。

1.3.3蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索從SDS-PAGE凝膠電泳上切下分離得到的目的蛋白點進(jìn)行胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，經(jīng)過脫色、肽提取、Matrix混合后，送中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院蛋白組學(xué)中心進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理測得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行錄入和處理。

圖1　耐藥株蛋白樣品第一次電泳的2-DE圖譜

圖2　耐藥株蛋白樣品第二次電泳的2-DE圖譜

2　結(jié)果

2.1PRSP的誘導(dǎo)通過次抑菌濃度誘導(dǎo)法，成功獲得PRSP，經(jīng)檢測MIC為3.84μg/ml，滿足次抑菌濃度誘導(dǎo)法對耐藥株的評定標(biāo)準(zhǔn)（誘導(dǎo)后MIC≥4倍誘導(dǎo)前MIC）和美國臨床實驗室國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (NCCLS)制定的SP對青霉素的MIC結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)（MIC≤0.06μg/ml為敏感，MIC在0.12～1.0μg/ml為中介，MIC≥2.0μg/ml為耐藥）。

2.2全菌蛋白2-DE的平行性分析將SP標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株的全菌蛋白按同一樣品、相同上樣量、兩次電泳的2-DE圖像上的點進(jìn)行檢測和匹配，結(jié)果顯示兩次2-DE的平行性較好，其匹配率達(dá)95%以上。結(jié)果見表1，圖1-3。

表1　同一樣品間的匹配率的比較

圖3　耐藥株兩次電泳的2-DE圖譜匹配結(jié)果

圖4 標(biāo)準(zhǔn)株的2-DE圖譜

圖5 耐藥株的2-DE圖譜

2.3菌株間蛋白圖譜的比較分析SP標(biāo)準(zhǔn)菌株和誘導(dǎo)菌株的蛋白圖譜非常相似，通過分析軟件在菌株中分別檢測到了各330，362個蛋白點，見圖4-5。

2.4菌株間差異蛋白點表達(dá)水平分析、鑒定在標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥株分離得到的蛋白點中，有10組20個點存在明顯的差異（表達(dá)量存在3倍以上差異），將其切下進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析及檢索。10個差異蛋白分別為：ABC轉(zhuǎn)運器、氨基酸ABC轉(zhuǎn)運器、DNA聚合酶Ⅲ、SP表面蛋白A、觸發(fā)因子、分子伴侶、脂蛋白、果糖二磷酸醛縮酶、α-烯醇化酶、假想蛋白。其中前5種蛋白在PRSP中表達(dá)水平升高，而后5種則表達(dá)水平降低。詳見圖6，表2。

3　討論

細(xì)菌的耐藥性主要通過以下5個途徑來實現(xiàn)：酶的滅活作用、細(xì)胞膜滲透性的改變、細(xì)菌的主動外輸機(jī)制、作用靶位的改變、細(xì)菌代謝狀態(tài)的改變[6]。長期研究認(rèn)為SP對青霉素耐藥機(jī)制主要是細(xì)菌細(xì)胞壁青霉素結(jié)合蛋白基因的改變和β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生[6-7]。耐藥病原體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究為研究耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提供了新的契機(jī)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)病原體內(nèi)哪些蛋白質(zhì)在抗生素的作用下發(fā)生改變，以及發(fā)生何種變化，根據(jù)這些變化，并以耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)作為研究點，可了解病原體耐藥的相關(guān)情況[8]。本研究中，我們成功誘導(dǎo)并建立了PRSP，并通過2-DE和質(zhì)譜技術(shù)對SP和PRSP的全菌蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定了兩者間表達(dá)水平差異較大的10個蛋白質(zhì)，這些蛋白可能在SP對青霉素耐藥過程中起到一定作用。

圖6　差異點在圖譜上的表現(xiàn)

本研究中ABC轉(zhuǎn)運器、氨基酸ABC轉(zhuǎn)運器、DNA聚合酶Ⅲ、SP表面蛋白A、觸發(fā)因子在耐藥菌株中表達(dá)量上調(diào)，這些蛋白可能和細(xì)菌耐藥有一定聯(lián)系。ABC轉(zhuǎn)運器為細(xì)菌多重耐藥主動流出機(jī)制之一[9-11]，其在PRSP中的表達(dá)水平顯著升高，說明ABC外排系統(tǒng)在PRSP的耐藥機(jī)制中也存在一定的作用，可能是PRSP產(chǎn)生的新機(jī)制之一。DNA聚合酶是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶，其中起主導(dǎo)作用的是polⅢ，具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，與DNA復(fù)制功能密切相關(guān)，其表達(dá)量的增加，表明耐藥菌株的DNA復(fù)制增強(qiáng)，一方面可以增加細(xì)菌量，另一方面有利于基因突變的產(chǎn)生，對細(xì)菌的耐藥產(chǎn)生一定的作用。SP表面蛋白A是存在于SP細(xì)胞壁表面的跨膜蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，能特異結(jié)合人分泌型免疫球蛋白IgA，參與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，是發(fā)病和感染的重要因素，也是最早確定的SP毒力因子之一[12]，其表達(dá)量增多，可能與耐藥株的毒力增強(qiáng)有關(guān)。觸發(fā)因子是一種核糖體結(jié)合的分子伴侶，其作用是參與蛋白質(zhì)的輸出，作為一個伴侶蛋白在一個開放的構(gòu)象中維持新蛋白質(zhì)的合成，其在耐藥機(jī)制中的作用有待于進(jìn)一步研究。

表2　差異表達(dá)蛋白點鑒定結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)分子伴侶、脂蛋白、果糖二磷酸醛縮酶、α-烯醇化酶、假想蛋白在耐藥菌株中表達(dá)下調(diào)。分子伴侶是一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，與胞內(nèi)蛋白的折疊與組裝密切相關(guān)，影響到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、定位或分泌,而且與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的信號分子的活性狀態(tài)與活性行為相關(guān)聯(lián)，具有重要的生理意義。許多分子伴侶是ATP酶，有報道證實GroES和GroEL是通過ATP方式來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊的一類分子伴侶[13]。其表達(dá)量下降，減弱了與非折疊多肽之間相互作用，造成錯誤聚集的肽段增加或不能誘導(dǎo)錯誤折疊的肽段發(fā)生正確的折疊，可能引起藥物作用靶位的改變而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。脂蛋白是脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，細(xì)菌脂蛋白是細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，約占膜成分的50%，其氨基末端含獨特的脂氨基酸[14]。可能是耐藥株P(guān)BPs的改變，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、成分的變化而引起脂蛋白表達(dá)量的改變，其實質(zhì)還有待研究。果糖二磷酸醛縮酶和α-烯醇化酶是具有糖酵解功能的多功能蛋白酶，其表達(dá)隨細(xì)胞病理生理、代謝、發(fā)育狀況的不同而改變。它們表達(dá)量的下降，說明PRSP的能量代謝降低，細(xì)菌可能處于營養(yǎng)缺陷狀態(tài)，結(jié)合Hiby等[15]研究，考慮這也可能是PRSP產(chǎn)生的新機(jī)制之一。本實驗假想蛋白的表達(dá)量降低，其具體功能和在SP的耐藥機(jī)制中的作用有待于進(jìn)一步研究探討。由于這些蛋白質(zhì)迄今尚沒有任何功能信息，因而它們的鑒定就顯得更有意義。通過生長階段依賴、壓力處理等比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，有可能為它們在細(xì)胞內(nèi)的功能提供一些提示，從而促進(jìn)人類對這些蛋白質(zhì)功能的認(rèn)識。

細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究是一個漫長而復(fù)雜的過程。本研究中，我們從蛋白質(zhì)分子的角度尋找與SP耐青霉素的相關(guān)蛋白，研究它們的種類及功能來探究RPSP的耐藥機(jī)制。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)并鑒定了10個差異蛋白，從而推斷出它們中的一些與靶位的改變、過量合成競爭性靶酶底物、主動外排作用和膜的改變等耐藥機(jī)制有一定的關(guān)系。對此，需要進(jìn)一步從基因組學(xué)的水平上對實驗結(jié)果加以驗證，這也為我們進(jìn)一步研究RPSP的耐藥機(jī)制開辟了新的方向。

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（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-05-19）

作者單位：312300紹興市上虞人民醫(yī)院檢驗科通信作者：王勇，E-mail：wang813927@163.com

Proteomic analysis of penicillin-resistant streptococcus pneumoniae strain

【Abstract】ObjectiveTo analyze the proteomics of penicillin-resistant streptococcus pneumonia(PRSP).MethodsThe penicillin-resistant streptococcus pneumonia strain was induced by sub-MIC method.The protein profile of Streptococcus pneumoniae and induced PRSP were examined by two-dimensional electrophoresis;and the electrophoretic patterns were analyzed by using Image Master 2D Platinum 5.0.The differentially expressed proteins were further identified by mass spectrometry. ResultsPRSP strains were induce successfully.Ten differentially expressed proteins were identified between Streptococcus pneumoniae and induced PRSP.The expression of ABC transporter,trigger factor,DNA Polymerase III,amino acid transport, pneumococcal surface protein A was increase in PRSP;while the expression of chaperonin GroES,lipoprotein,fructose bisphosphate aldolase,α-enolase decreases,hypothetical protein SpneT_02001699 was decreased.ConclusionThe findings of proteomics change in penicillin-resistant streptococcus pneumoniae may provide laboratory evidence for further study of drug resistance mechanisms.

【Key words】PRSPProteomic2-DEMass spectrometry