周琴 李光乾 張勤

驚厥持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬TLR4、IL-1β的表達及意義

周琴 李光乾 張勤

目的 觀察大鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)（status convulsion，SC）后海馬的病理改變及TLR4、IL-1β的動態(tài)表達,闡明免疫反應在驚厥性腦損傷發(fā)病機制中的作用。方法88只SD大鼠分為生理鹽水組（A組）、SC組（B組），B組用氯化鋰-匹羅卡品法成功制作SC模型后，再分為B1-B4組（分別于驚厥后4、24、48和72h處死）。光鏡觀察大腦皮層及海馬各區(qū)形態(tài)學改變，電鏡確認海馬CA1區(qū)神經元超微結構變化，RT-PCR檢測海馬TLR4、IL-1β mRNA的動態(tài)表達。結果長程驚厥發(fā)作后，大鼠海馬神經元的損傷存在動態(tài)變化，隨著觀察時間的延長，72h內病變逐漸加重。TLR4 mRNA于驚厥后4h開始升高（P＜0．05），并隨時間延長逐步增高，于72h時達到高峰點（P＜0．01），而IL-1βmRNA在驚厥后4h即達高峰（P＜0．01），此后隨時間延長而下降，至72h時已降至正常水平（P＜0．05）。結論TLR4和IL-1β參與了驚厥性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，且IL-1β的早期升高可能對TLR4的生成有間接促進作用。

驚厥 腦損傷 大鼠 Toll樣受體4 白介素1β

近年來，炎癥和免疫反應在驚厥后腦損傷中的作用日益受到重視。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是1997年被發(fā)現(xiàn)的天然免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體，可與病原識別模式分子結合，通過誘導核因子-κB（NF-κB）的活化，而引發(fā)白介素1β（IL-1β）等炎癥細胞因子的表達，成為聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫的紐帶[1]。本研究通過建立驚厥持續(xù)狀態(tài)（status convulsion，SC）大鼠模型，觀察驚厥后腦組織形態(tài)學改變和海馬TLR4、IL-1β表達的動態(tài)變化，從分子水平進一步闡明免疫反應在驚厥性腦損傷發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 氯化鋰（K73036）、匹羅卡品（K80477）購于美國Fluka公司，溴化甲基東莨菪堿（S8502）購至sigma公司。TRI Reagent總RNA提取試劑盒（TR-118）為MRI公司產品，RT-PCR試劑盒（DRR023A）由TaKaRa公司提供。

1.2 動物分組與模型制作 清潔級雄性SD大鼠88只，體重170～230g，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供[合格證號：SYXK（浙）2005-0061]。于溫州醫(yī)學院實驗動物中心層流實驗室飼養(yǎng)，相對濕度70%，溫度25℃，晝夜照明12h/12h變化。按隨機數(shù)字表法將實驗動物分為生理鹽水組（A組，16只）、SC組（B組,72只），B組再分為B1～B4組（分別于驚厥后4、24、48和72 h處死，每組18只）。SC模型制作方法如下：大鼠先予腹腔注射3mEq/kg的氯化鋰，18h后予溴化甲基東莨菪堿1mg/kg，30min后予注射匹羅卡品45mg/kg。大鼠驚厥程度分級：0級：無驚厥發(fā)作；Ⅰ級：面部抽動；Ⅱ級：節(jié)律性點頭；Ⅲ級：前肢陣攣抽搐；Ⅳ級：全身強直伴站立；Ⅴ級：全身強直陣攣。當大鼠驚厥時間達30min時給予10%的水合氯醛400mg/kg、阿托品1mg/kg止驚。驚厥程度達Ⅳ級以上，持續(xù)達30min，驚厥后大鼠一般狀況良好的為合格SE大鼠模型。A組以生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）取代匹羅卡品，余用藥同B組。

1.3 腦組織形態(tài)學檢查 造模成功后各組大鼠按相應時間點處死，400mg/kg水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛緩沖液固定左半球，常規(guī)石蠟包埋，從視交叉處開始作連續(xù)冠狀位切片，HE染色。重點觀察海馬CA1、CA3區(qū)，顳、頂葉皮層及齒狀回神經元改變。每組中任選2只大鼠腦海馬，做600A超薄切片，透射電鏡（日立H600）觀察細胞超微結構變化。

1.4 RT-PCR檢測大鼠海馬TLR4、白細胞介素-1（IL-1）β的mRNA表達 每組取6只海馬標本，稱取50～100mg制作勻漿，總RNA提取采用TRI Reagent，按照TaKaRa公司試劑盒說明書進行逆轉錄反應。用β肌動蛋白（βactin）作為PCR反應的內參照，引物序列及反應條件：（1）TLR4：5′-GCCGGAAAGT TATTGTGGTGGT-3，5′-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′；94℃3min后，按94℃30s，59℃30s，72℃1min，反復循環(huán)32次，72℃延伸5min終止，產物長度356bp。（2）IL-1β引物序列：5′-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3，5′-TGCTGATGT ACCAGTTGGGG-3′，94℃預變性3min，94℃30s，62℃30s，72℃1min，反復循環(huán)33次，72℃延伸5min終止，產物長度247 bp；（3）β-actin：5′-CTACAATGC TGCGT GTGG-3′，5′-ATGGCTACGTACATGGCTGG-3′，產物長度138bp；β-actin和TLR4、IL-1β同管擴增。取5μl反應產物行瓊脂糖凝膠電泳。用數(shù)字成像系統(tǒng)SmartView分析產物光密度值，以各目的條帶的光密度值與內參照βactin的光密度值比，作為其mRNA水平的指標。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料采用表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 光鏡觀察腦組織形態(tài)學變化 HE染色后，正常鼠神經元胞核大而圓，位于細胞中央，異染色質少，似空泡狀，呈淡藍色，中央有一清楚核仁，胞質呈淡紅色，多有突起（圖1）。在驚厥發(fā)作4h后驚厥大鼠海馬可見部分神經元出現(xiàn)變性，表現(xiàn)為核染色質腫脹、粗大、細胞腫脹、核仁消失致空泡狀細胞核（圖2）；隨驚厥后觀察時間的延長逐步出現(xiàn)核膜破裂，核溶解，胞質空化，而后出現(xiàn)胞膜皺縮，胞漿濃縮，細胞呈不規(guī)則形或三角形（圖3），神經元周圍出現(xiàn)空隙；最終因核溶解消失，整個細胞呈均勻一致的紅色（圖4）。病變以海馬CA3區(qū)最明顯，CA1區(qū)、齒狀回及顳葉皮質亦可見到病變神經元，并于驚厥后48～72h達高峰。

2.2 電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結構 A組大鼠海馬CA1區(qū)神經元細胞規(guī)則，核糖體及粗面內質網(wǎng)結構清楚，線粒體呈橢圓形，嵴規(guī)則，核呈圓形，核膜平滑，核仁清楚，常染色質分布均勻（圖5）。大鼠驚厥發(fā)作后4h，CA1區(qū)神經纖維已有明顯的水腫改變，大多數(shù)神經元尚無明顯變化（圖6）。驚厥后24h，神經元出現(xiàn)明顯的細胞變性改變：主要表現(xiàn)為核呈不規(guī)則多邊形，核膜皺縮曲折，核仁變形邊集，染色質大小分布失調；線粒體明顯腫脹，部分高爾基體、內質網(wǎng)輕度擴張（圖7）。驚厥后48～72h，神經元出現(xiàn)凋亡樣改變：大部分的粗面內質網(wǎng)都出現(xiàn)腫脹，多數(shù)線粒體、高爾基體擴張、空泡樣改變，出現(xiàn)“暗神經元”樣改變，表現(xiàn)為胞核及胞質固縮，結構致密，但核膜完整（圖8）。

2.3 海馬TLR4、IL-1β的mRNA表達的改變 A組海馬有極少量的TLR4 mRNA的表達，B組各時間點TLR4 mRNA的表達均較對照組高（P＜0.05或0.01），并隨著驚厥后觀察時間的延長逐步升高，于驚厥后72h達高峰。IL-1β mRNA在A組海馬僅有微量表達，B組于驚厥后4h迅速達高峰（P＜0.01），并隨時間的增長逐漸降低，于72h時降至正常水平（P＞0.05），見表1，圖9-10。

3 討論

驚厥是小兒常見疾病，是由于中樞神經系統(tǒng)或各種全身性疾病使腦細胞功能紊亂，部分神經元突然異常放電所致。其發(fā)病率為3%～4%，其中20%為反復發(fā)作性驚厥或SC。研究發(fā)現(xiàn)驚厥可引起腦損傷，國內外已對其機制進行了大量的研究，近年來發(fā)現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)對各種刺激（如缺血缺氧、驚厥等）具備完全的免疫炎性反應能力。我們之前的研究也證實：免疫炎癥反應參與了驚厥后腦損傷的發(fā)病過程[2]。

圖1 A組海馬CA1區(qū)正常神經元（HE染色,×200）

圖2 B1組海馬CA1區(qū)神經元腫脹（HE染色，×200）

圖5 正常神經元、線粒體和高爾基復合體（電鏡下，×25 000）

圖3 B3組海馬CA1區(qū)神經元皺縮變形（HE染色，×200）

圖4 B4組海馬CA1區(qū)神經元紅色樣變（HE染色，×200）

圖6 B1組海馬CA1區(qū)毛細血管周圍水腫（電鏡下，×8 000）

圖7 線粒體和高爾基復合體擴張，空泡化（電鏡下，×25000）

圖8 胞質空泡化，核仁溶解消失（電鏡下，×8 000）

圖9 大鼠海馬TLR4 mRNA表達（M：maker；1：A組；2：B1組；3：B2組；4：B3組；5：B4組）

圖10 大鼠海馬IL-1βmRNA表達（M：maker；1：A組；2：B1組；3：B2組；4：B3組；5：B4組）

表1 各組大鼠海馬TLR4、IL-1βmRNA表達的動態(tài)變化

TLRs是表達于上皮細胞、內皮細胞和天然免疫細胞等表面的最重要模式識別受體，通過亮氨酸重復序列LRRs（leucine-rich repests）結構域識別病原體相關分子模式（pathogen associated molecular patterens，PAMPs），刺激炎癥因子的產生，參與病原體的殺傷[3]。TLRs與腦損傷的聯(lián)系是始于對各種不同病原體感染誘發(fā)腦內免疫炎癥反應的研究。隨著認識的深入，發(fā)現(xiàn)一些非感染因素，如缺血缺氧、氧化應激和缺血再灌注等引起的腦損傷也與TLRs密切相關。TLR4是TLRs家族中最復雜，被研究最多的成員。它是一種I型跨膜蛋白，由胞外的LRR結構域和胞內保守的Toll/IL-1受體（TIR）結構域構成。TLR4活化后，其信號的特異轉導主要通過TIR結構域與下游接頭分子Mal/TIRAP和TRAM/TRIF結合，從而激活MyD88依賴和TRIF依賴兩條信號通路，進一步活化NF-κB，游離的NF-κB進入細胞核發(fā)揮轉錄調控作用，激活IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a、IFN-γ等細胞因子的基因表達[4]。Maroso等[5]在海人酸誘導的小鼠癲癇模型中觀察到，TLR4在癲癇小鼠的海馬神經細胞、星型膠質細胞、小膠質細胞大量表達，應用TLR4拮抗劑后癲癇發(fā)作程度下降。而TLR4缺陷的C3H/HJ型小鼠具有抵抗癲癇發(fā)作的功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠驚厥后4h海馬TLR4mRNA的表達已有明顯增加，在驚厥后24～72h，隨時間推移，TLR4 mRNA的表達逐步升高（P＜0.05），均高于對照組。與此同時，光鏡、電鏡觀察海馬神經元，均顯示其形態(tài)學病理變化隨時間的延長而嚴重，于72h達高峰。TLR4 mRNA的表達增高趨勢與海馬的病理改變趨勢一致，提示TLR4 mRNA參與了驚厥后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，且可能主要參與在后期的表達。

IL-1是參與神經調節(jié)的重要因子，在體內主要以3種形式存在：IL-1α和IL-1β，其中IL-1β是主要分泌形式，也是中樞神經系統(tǒng)中存在的主要形式[7]。研究發(fā)現(xiàn)IL-1參與了驚厥及驚厥性腦損傷。在癲癇大鼠模型中，驚厥4h后海馬、丘腦等部位即可見IL-1β mRNA及其蛋白表達增加[8]。在癲癇患者手術切除的海馬組織中，發(fā)現(xiàn)IL-1β及其受體表達增高，炎癥細胞浸潤增多[9]。而通過特異性阻斷白細胞介素轉換酶（ICE/caspase-1）抑制IL-1β的生成，可使大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長，發(fā)作持續(xù)時間明顯縮短[10]。本研究表明B組IL-1β mRNA在末次驚厥后4h即迅速達到高峰，與A組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），此后隨著觀察時間的延長逐步降低，至72h基本降至正常水平。此結果提示，IL-1β可能參與了驚厥發(fā)作的始動過程，也可能是早期驚厥性腦損傷及神經元病理損害的原因之一。

但本研究結果發(fā)現(xiàn)，早期升高的IL-1β mRNA隨后逐漸下降，于驚厥72h后已降至正常水平，但大鼠海馬的病理損傷在驚厥停止后仍呈進行性加重過程。為什么腦組織病理改變和IL-1β的后期表達呈現(xiàn)相反的趨勢？研究發(fā)現(xiàn)，IL-1ra是一種內源性的IL-1受體拮抗劑，通過與IL-1β受體競爭結合位點起抑制IL-1β活性的作用。驚厥早期IL-1β和IL-1ra幾乎同時被激活，但IL-1ra的活化速度較IL-1β慢，呈現(xiàn)一延遲過程。因此，在驚厥后的早期，IL-1β表達占主導，但隨后IL-1ra逐步活化，IL-1β的活性逐漸被抑制[11]。本實驗結果顯示：IL-1β mRNA的表達高峰（4h）較TLR4 mRNA（72h）早，且當TLR4表達量逐漸增加時，IL-1β反而逐步下降，這似乎與TLR4介導IL-1β的表達這一理論相悖。但Toshchakov等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的接頭分子和特異性穿膜肽可以抑制MyD88依賴信號通路活化的NF-kB的轉錄和早期IL-1β的表達。因此在驚厥后期，隨著TLR4表達量的逐漸增加，早期活化的IL-1β反而受到抑制逐步下降。IL-1β的活性在受到多種途徑的抑制后，驚厥發(fā)作后的進行性免疫炎癥損傷又是通過何種途徑來介導呢？研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可以誘導肺泡表面上皮細胞TLR4表達的激活[13]，且IL-1β的編碼基因又是NF-κB的反應基因，NF-κB可以上調其表達，而IL-1β又可以通過誘導環(huán)磷酸腺苷的生成，反饋激活神經膠質細胞中NF-κB的表達[14]。因此，我們推測驚厥性腦損傷早期IL-1β的生成可能對此后TLR4表達上調有間接促進作用。而后期活化的TLR4也可能抑制了IL-1β的過度表達，兩者呈現(xiàn)反饋抑制的過程。

綜上所述，TLR4和IL-1β參與了驚厥性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，且IL-1β的早期升高可能對TLR4的生成有間接促進作用，而激活的TLR4可能抑制IL-1β的過度表達。進一步明確TLR/TIR通路在驚厥性腦損傷免疫應答過程中的作用，對于有效防治驚厥后的腦損害具有重要的理論和實際意義。

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Expression of TLR4 and IL-1β in hippocampus of rats after status convulsion

Objective To observe the changes of neuron pathology and the expression of TLR4 and IL-1β in hippocampus of rats after status convulsion．MethodsEighty eight male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into control group(A)and convulsion group(B)．The status convulsion was induced by injection of lithium chloride-pilocarpine in group B, then the animals were sacrificed at 4h,24h,48h,72h after convulsion discontinued (subgroup B1-B4)．The histopathological changes in hippocampus were observed by HE staining and electron microscopy,the expression of TLR4 and IL-1β mRNA in hippocampus were detected by RT-PCR．ResultsNeuronal injury was observed in group B by HE staining and electron microscopy,and the changes were increased gradually at 72h after convulsion,Compared with controls the expression of TLR4 mRNA in rat hippocampus of group B started to increase at 4h(P＜0．05)and reached the peak at 72h after convulsion;while the expression of IL-1βmRNA reached the peak at 4h(P＜0．01),then gradually decreased and returned to normal at 72h after convulsion P＞0．05)．ConclusionThe expression of TLR4 and IL-1β may be associated with brain injury in SC rats,and the early increased IL-1β expression may promote the expression of TLR4．

Convulsion brain injury Rat Toll like receptor 4 IL-1β

2014-03-17）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省中醫(yī)藥科學研究基金計劃（2011ZB014）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院兒科（周琴、張勤）；杭州市兒童醫(yī)院神經科（李光乾）

張勤，E-mail：zq0966@163.com