許 月，朱 丹，魏文毅，牛廣財(cái) *，陳 璐，譚 慧

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑木耳在我國(guó)具有多年的栽培歷史，主產(chǎn)區(qū)在吉林、黑龍江、湖北等地，規(guī)模大、產(chǎn)量高、質(zhì)量好。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)出產(chǎn)的黑木耳品質(zhì)和產(chǎn)量均居世界首位，年產(chǎn)量已達(dá)到100多萬t。全世界超過90%的黑木耳產(chǎn)自中國(guó)，我國(guó)生產(chǎn)的黑木耳除少部分出口外，絕大多數(shù)為國(guó)內(nèi)消費(fèi)。由于黑木耳是一種食藥兼用菌，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且有很好的保健效果，被稱為“素中之葷”[1]。目前，我國(guó)黑木耳加工業(yè)還處于發(fā)展的初級(jí)階段，黑木耳加工產(chǎn)品的市場(chǎng)占有額不足整個(gè)銷售市場(chǎng)的5%[2]。近年來，人們對(duì)黑木耳含量較高的有效成分，如多糖、膳食纖維、黑色素、多酚等進(jìn)行了較深入的研究[3-8]。同時(shí)，研制的黑木耳深加工制品種類也比較豐富，一類是非發(fā)酵制品，如黑木耳紙狀風(fēng)味休閑食品、黑木耳脆片、黑木耳軟糖、黑木耳餅干、黑木耳果醬果凍、黑木耳冰淇淋、黑木耳核桃復(fù)合乳飲料等[9-17]；另一類是發(fā)酵類制品，如黑木耳發(fā)酵飲料、黑木耳酸奶等[18-21]。

隨著人們對(duì)保健食品的追求，發(fā)酵類制品越來越受到關(guān)注。目前，黑木耳乳酸發(fā)酵飲料、黑木耳豆奶的直投式乳酸菌發(fā)酵飲料等產(chǎn)品的研究開發(fā)較多[22-24]。但是，在黑木耳乳酸發(fā)酵制品的開發(fā)中，絕大多數(shù)是以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為菌種，而且必須添加奶源，這一定程度上限制了黑木耳發(fā)酵制品的種類和產(chǎn)品風(fēng)味。本試驗(yàn)擬選用植物乳桿菌和短乳桿菌作為發(fā)酵劑，無需添加奶源，采用響應(yīng)面法對(duì)黑木耳乳酸發(fā)酵的工藝參數(shù)進(jìn)行研究，以期為黑木耳乳酸發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：黑龍江省大慶市批發(fā)市場(chǎng)；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.557、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）1.12：黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所；果膠酶（4×105U/g）：上海致化化學(xué)科技開發(fā)有限公司；纖維素酶（5×104U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；木瓜蛋白酶（1.2×106U/g）：河北天旭實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物公司；白砂糖（食品級(jí)）、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BCN-1360超級(jí)潔凈工作臺(tái)：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L420臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定指標(biāo)

總酸測(cè)定：GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法[25]。

1.3.2 黑木耳乳酸發(fā)酵工藝路線

1.3.3 操作要點(diǎn)

黑木耳干品在常溫水中浸泡2～3 h，泡發(fā)好的黑木耳與純凈水按質(zhì)量比1∶6的比例混合打碎，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.4%的混合酶（果膠酶/纖維素酶/木瓜蛋白酶=1∶1∶8），在55 ℃條件下恒溫振蕩4 h得到黑木耳酶解液。在黑木耳酶解液中加入適量白砂糖，經(jīng)高壓滅菌后接入乳酸菌，在適宜條件下培養(yǎng)，即完成黑木耳的乳酸發(fā)酵。

1.3.4 菌種的選擇

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經(jīng)滅菌后，分別接入植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，LB），植物乳桿菌與短乳桿菌按1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、1∶3、1∶4比例的混合菌，接種量為6%，在36 ℃條件下培養(yǎng)，一定時(shí)間后測(cè)其總酸含量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

（1）發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳產(chǎn)酸量的影響

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經(jīng)滅菌后接入混合菌6%，在38 ℃條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、60 h、72 h、84 h，測(cè)其總酸含量。

（2）發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳產(chǎn)酸量的影響

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經(jīng)滅菌后接入混合菌6%，分別在32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)其總酸含量。

（3）接種量對(duì)黑木耳產(chǎn)酸量的影響

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，經(jīng)滅菌后，分別接入3%、4%、5%、6%、7%混合菌，在38 ℃條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)其總酸含量。

（4）加糖量對(duì)黑木耳產(chǎn)酸量的影響

黑木耳酶解液中分別加入5%、6%、7%、8%、9%、10%白砂糖，經(jīng)滅菌后，接入混合菌6%，在38 ℃條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)其總酸含量。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以總酸（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素水平編碼見表1。數(shù)據(jù)用Design 8.0.6.1程序分析。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels of Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的選擇

如圖1所示，菌種編號(hào)1～9分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）單一菌、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，LB）單一菌、植物乳桿菌（LP）與短乳桿菌（LB）按1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、1∶3、1∶4的比例混合菌。在培養(yǎng)24 h、48 h、60 h、72 h時(shí)分別測(cè)其總酸的含量。結(jié)果表明，在發(fā)酵48 h時(shí)，產(chǎn)酸增速最大。植物乳桿菌與短乳桿菌以2∶1比例混合菌在各時(shí)段產(chǎn)酸情況均較好，優(yōu)于其他比例混合菌。這是因?yàn)榛旌暇N共同生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生協(xié)同發(fā)酵作用，植物乳桿菌發(fā)酵形成的良好環(huán)境，也促進(jìn)了短乳桿菌的快速生長(zhǎng)；同時(shí)，短乳桿菌的生長(zhǎng)代謝也會(huì)促進(jìn)植物乳桿菌的增殖，兩者的混合菌種能在較短的時(shí)間迅速產(chǎn)生乳酸，提高了黑木耳酶解發(fā)酵基質(zhì)的產(chǎn)酸量。故菌種選為植物乳桿菌與短乳桿菌以2∶1比例混合菌。

圖1 不同菌種在不同發(fā)酵時(shí)間下對(duì)總酸含量的影響Fig.1 Effects of different strains on total acid content at different fermentation time

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響

由圖2可知，48～72 h的發(fā)酵過程中，產(chǎn)酸較緩慢，總酸含量呈緩慢上升趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵至84 h時(shí)，增速最快，產(chǎn)酸含量最高達(dá)到10.18 g/L。在發(fā)酵至96 h時(shí)，總酸含量變化不大，趨于平穩(wěn)，可見發(fā)酵已接近尾聲。由此，選擇發(fā)酵時(shí)間范圍60～84 h進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響Fig.2 Effects of fermentation time on acid production of black fungus

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響

由圖3可知，32 ℃時(shí)發(fā)酵速度較慢，產(chǎn)酸較低。34～38 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，發(fā)酵逐步劇烈，產(chǎn)酸速度逐步提升，38 ℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，達(dá)到7.23 g/L。當(dāng)溫度在38 ℃以后時(shí)，總酸含量沒有繼續(xù)升高反而開始下降，這與溫度較高，超過菌種最適宜的發(fā)酵溫度有關(guān)。綜合考慮總酸含量，選擇發(fā)酵溫度范圍36～40 ℃進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on acid production of black fungus

2.2.3 接種量對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響

由圖4可知，接種量為3%時(shí)，產(chǎn)酸水平最低，為7.54 g/L。接種量為4%時(shí)，總酸含量最高，達(dá)到8.52 g/L。之后隨著接種量不斷增加，在接種量為5%～7%范圍時(shí)，總酸含量呈下降趨勢(shì)。這說明接種量過多或者過少，均不利于乳酸菌的繁殖和產(chǎn)酸。接種量過低時(shí)，由于其基數(shù)少，菌的數(shù)量增加相對(duì)緩慢；接種量過高時(shí)，由于較高酸度又會(huì)抑制乳酸菌的繼續(xù)繁殖與生長(zhǎng)。所以，選擇3%～7%的接種量范圍進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 接種量對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響Fig.4 Effect of inoculum on acid production of black fungus

2.2.4 加糖量對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響

由圖5可知，在加糖量為3%～7%范圍時(shí)，隨著糖量的增加，總酸含量逐漸升高，在7%加糖量時(shí)達(dá)到最大值8.38 g/L。隨著加糖量的繼續(xù)增加，在9%～11%時(shí)，總酸含量出現(xiàn)了明顯的下降，可能是加糖量過高，滲透壓增加，乳酸菌利用不了所導(dǎo)致的。因此，選擇加糖量5%、7%和9%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 加糖量對(duì)黑木耳產(chǎn)酸情況的影響Fig.5 Effects of the sugar addition on acid production of black fungus

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳乳酸發(fā)酵的發(fā)酵條件

2.3.1 回歸方程建立與方差分析

響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2，試驗(yàn)結(jié)果通過Design 8.0.6.1數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸方程為：

二次多項(xiàng)模型的方差分析見表3，其模型的F值為39.55，說明該模型有意義。P＜0.05，模型極顯著，其中X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32均為顯著性模型項(xiàng)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Designs and results of response surface analysis

由表3可知，失擬項(xiàng)的F值為3.37，P＞0.05，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于純誤差來說不顯著。該失擬項(xiàng)說明模型的擬合性較好，可以用于模型分析。模型的校正決定系數(shù)為R2=0.950 7，說明95.07%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此模型來解釋。本模型的信噪比＞4，達(dá)到了23.415，該模型可用，說明該模型可以用于實(shí)際應(yīng)用中。

2.3.2 最優(yōu)值的確定

根據(jù)多元二次回歸方程，以總酸為響應(yīng)值，對(duì)各因素水平進(jìn)行優(yōu)化，得到黑木耳乳酸發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間83.99 h、發(fā)酵溫度36 ℃、接種量3%、加糖量5%。在此條件下總酸的最大預(yù)測(cè)值為9.96 g/L。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行黑木耳乳酸發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳條件修正為發(fā)酵時(shí)間84 h、發(fā)酵溫度36 ℃、接種量3%、加糖量5%。該條件下實(shí)際測(cè)得的總酸含量為（9.75±0.21）g/L，與預(yù)測(cè)值相差＜5%?？梢姡貧w方程的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間具有較好的擬合度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

3 結(jié)論

植物乳桿菌與短乳桿菌以2∶1的比例混合發(fā)酵黑木耳漿時(shí)，產(chǎn)酸效果最好。通過單因素試驗(yàn)，確定各因素對(duì)黑木耳乳酸發(fā)酵產(chǎn)酸情況的影響。通過響應(yīng)面優(yōu)化方法，確定黑木耳乳酸發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間84 h、發(fā)酵溫度36 ℃、接種量3%、加糖量5%。在此條件下的產(chǎn)酸量為（9.75±0.21）g/L。

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