周堅喬，羊 悅，楊勝利*

（浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014）

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）為我國特有的名貴藥用真菌。蟲草中含有多種生理活性物質，中醫(yī)藥文獻認為冬蟲夏草味甘性溫，有泌精益氣、保肺補腎、止血化痰的功效[1-3]。近代醫(yī)學臨床研究表明，冬蟲夏草能治療勞咳痰血、盜汗、陽痿、遺精、黃膽病、肺結核及老年衰弱、慢性咳喘等癥，有強壯兼收斂鎮(zhèn)靜的效果[4-7]。冬蟲夏草所含蟲草素能明顯增強紅細胞黏附腫瘤細胞的能力，抑制腫瘤生長和轉移，能明顯提升白血球和血小板數量，迅速改善放化療后的嘔吐惡心、胃口差、頭發(fā)脫落、失眠等癥狀[8-12]。但天然的冬蟲夏草產量十分稀少，因此，采用培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體來替代天然冬蟲夏草。目前，人工蟲草菌絲體的生產多以液體深層發(fā)酵為主。隨著研究的深入，蟲草也被廣泛應用于保健食品的開發(fā)，如蟲草酒、蟲草飲料和蟲草藥膳。目前蟲草素的研究現(xiàn)正成為食品保健和藥物化學中一個極其活躍的領域。蟲草菌深層發(fā)酵的產物直接作為食品雖然還未能為人們接受，但被加工成口服液、營養(yǎng)液、食品添加劑、軟飲料、含酒精飲料等，已逐漸被人們所接受。蟲草液體發(fā)酵產物的另一個主要用途是其代謝提取物。即從深層發(fā)酵產物中提取多種有效成分，如多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇、苷類、酚類、酶、核酸、氨基酸、維生素等。

硒是人和動物體內必需的一種元素，缺硒可以導致多種癥狀[13-15]。如人體缺硒會誘發(fā)心血管疾病、癌癥、克山病及大骨節(jié)病等[16-17]，而動物缺硒主要表現(xiàn)為白肌病和生長緩慢等[18-20]。如牛缺硒時，會出現(xiàn)骨骼肌和心肌變性，生長緩慢，消瘦，犢牛腹瀉；豬缺硒時，表現(xiàn)為肝營養(yǎng)不良，仔豬出現(xiàn)白肌病、?？靶?、胃潰瘍等。硒在菌絲體內主要以硒蛋白和硒多糖的形式存在。其中，硒半胱氨酸是構成某些酶活性中心的重要組分，其作用是充當氧化還原中心。硒多糖具有重要的藥理活性如免疫調節(jié)、抗腫瘤等。

啤酒糟是啤酒加工副產物，通過微生物將其轉化為營養(yǎng)豐富、適口性好、附加值高、經濟效益顯著的食品添加劑或者微生物飼料是最經濟有效的方法之一。廢渣中含有大量的營養(yǎng)物質，經微生物發(fā)酵后，可轉變成更加有效的生物活性物質，作為動物飼料不僅能夠提高飼料的營養(yǎng)價值，更能提高畜禽的抗病能力和生產能力。如果將這些活性成分進一步分離純化，可以作為食品添加劑甚至是藥品。

本研究采用冬蟲夏草作為富硒的載體，啤酒糟作為基質，進行富硒冬蟲夏草液態(tài)深層發(fā)酵工藝優(yōu)化。研究冬蟲夏草對無機硒的生物轉化能力，為富硒冬蟲夏草的進一步研究應用打下基礎。以蟲草為出發(fā)菌株，啤酒糟為基質發(fā)酵生產相應的產品，不僅能夠提高農業(yè)副產物附加值，更能創(chuàng)造良好的社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

冬蟲夏草：梁山正大食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液20%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.15%，瓊脂2%。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液20%，葡萄糖2%，蛋白胨l%，酵母提取物1%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.15%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒糟1%～3%，亞硒酸鈉（Na2SeO3）10～30 mg/L。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）：上海青析化工科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：南通東海龍生物制品有限公司；酵母膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；磷酸二氫鉀（分析純）：湖州湖試劑化學試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）：上海申博化工有限公司；亞硒酸鈉（分析純）：上海鶴善生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PerkinElmer AAanalvst 800原子吸收分光光度計：美國珀金埃爾默公司；HZQ-2數顯全溫振蕩器、SPX-150智能生化培養(yǎng)箱：常州邁科諾儀器有限公司；CP323S電子天平：德國賽多利斯天平公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

250 mL搖瓶裝液量50 mL，接種斜面菌塊，置于搖床中，轉速160 r/min，20 ℃培養(yǎng)4 d。

1.3.2 亞硒酸鈉添加量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的質量濃度分別為10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L，接種量10%，轉速200 r/min，20 ℃培養(yǎng)10 d，測定富硒蟲草菌絲體中硒的含量。

1.3.3 啤酒糟添加量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中啤酒糟的質量濃度分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L，接種量10%，轉速160 r/min，20 ℃培養(yǎng)10 d，測定富硒蟲草菌絲體中硒的含量。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，考察pH值、接種量、轉速對菌絲體生長和富硒量的影響，選定這3個因素，進行正交試驗L9（33），其因素和水平見表1。

表1 冬蟲夏草發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization of Cordyceps sinensis

1.3.5 分析方法

（1）生物量測定

采用干重法。發(fā)酵液經4 000 r/min離心15 min去除上清液，菌絲體用去離子水洗滌3次后離心，置于烘箱內60 ℃烘干至質量恒定后稱質量。

（2）硒含量測定

采用原子吸收分光光度法測定菌絲體中硒的含量。

2 結果與分析

2.1 富硒蟲草菌絲體的生長

將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量。接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在160 r/min、20 ℃條件下培養(yǎng)。每隔1 d取樣測定菌絲體干質量，以生物量（菌絲體干質量）為縱坐標，發(fā)酵時間（d）為橫坐標繪制菌體生長曲線，結果如圖1所示。

圖1 富硒冬蟲夏草生長曲線Fig.1 Growth curve of selenium-rich Cordyceps sinensis

由圖1可知，培養(yǎng)10 d 內，富硒冬蟲夏草菌絲體的生物量隨著時間的增加逐漸增長，在第10天達到最大值，第10天之后菌體出現(xiàn)自溶，因此，后續(xù)試驗選擇培養(yǎng)時間為10 d。

2.2 啤酒糟添加量對冬蟲夏草菌絲體富硒量的影響

以冬蟲夏草為出發(fā)菌株，優(yōu)化啤酒糟的質量濃度，分別選擇10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L 和30 g/L，添加25 mg/L Na2SeO3，pH值為6，接種量為10%，在溫度為20 ℃，搖瓶轉速為160 r/min條件下培養(yǎng)10 d，考察啤酒糟的添加量對蟲草菌絲體富硒量的影響，結果如圖2所示。

圖2 啤酒糟添加量對蟲草生物量和富硒量的影響Fig.2 Effect of beer distiller’s grains’addition on biomass and selenium accumulation amount

由圖2可知，隨著啤酒糟質量濃度的增加，生物量和富硒量都在增加，啤酒糟質量濃度在20 g/L 達到最大值。從實驗過程來看，隨著啤酒糟質量濃度的增加，培養(yǎng)基也逐漸變黏稠，啤酒糟質量濃度＞30 g/L，培養(yǎng)基的流動性受到影響，因此，影響到養(yǎng)分的傳遞和吸收，也會影響代謝產物的釋放。同時蟲草菌是好氧菌，也對溶氧受到影響，將直接影響生物量和富硒量。因此選擇啤酒糟質量濃度為20 g/L。

2.3 亞硒酸鈉添加量對冬蟲夏草菌絲體富硒量的影響

以冬蟲夏草為出發(fā)菌株，啤酒糟質量濃度為20 g/L，pH值為6，接種量為10%，在溫度為20 ℃，搖瓶轉速為160 r/min條件下，培養(yǎng)10 d，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的質量濃度分別為10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L對蟲草菌絲體富硒量的影響，結果如圖3所示。

圖3 亞硒酸鈉添加量對冬蟲夏草菌絲體富硒量的影響Fig.3 Effect of sodium selenite addition on selenium accumulation in Cordyceps sinensis

由圖3可知，隨著亞硒酸鈉質量濃度的升高，富硒量也在增加，但增加到一定程度又開始下降，可能是因為高濃度的亞硒酸鈉有劇毒。當培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質量濃度為10～25 mg/L時，蟲草可以生長并在菌絲體內富集硒，說明蟲草對低濃度的亞硒酸鈉具有耐受性，并且最適亞硒酸鈉添加量為25 mg/L。

2.4 發(fā)酵條件對蟲草菌絲體富硒量的影響

為考察不同發(fā)酵條件對菌絲體生長和富硒量的影響，試驗選pH值、接種量、轉速3因素，在裝液量為50 mL/250 mL，發(fā)酵溫度20 ℃，加亞硒酸鈉質量濃度25 mg/L，啤酒糟質量濃度20 g/L，培養(yǎng)時間10 d的條件下，進行L9（33）正交試驗，在參考已知文獻及前期試驗的基礎上，以總富硒量（菌絲干質量×硒含量）為評價指標，優(yōu)化液態(tài)深層發(fā)酵工藝。正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 冬蟲夏草液態(tài)深層發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for submerged fermentation conditions optimization of Cordyceps sinensis

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表2可知，各因素對蟲草菌絲體的生長和富硒量的影響作用大小為轉速＞接種量＞pH值。確定冬蟲夏草菌絲體的富硒量的最佳工藝條件為A2B3C3，即pH值為7，接種量15%，轉速為180 r/min。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗，總富硒量為5 808.20 μg/L。

由表3可知，各因素對蟲草菌絲體富硒量影響大小順序為C（轉速）＞B（接種量）＞A（pH值），搖床轉速對結果的影響有顯著影響，而接種量和pH值對結果無顯著影響。

3 結論

富硒微生物是一種高效、安全、營養(yǎng)均衡的補硒制劑。富硒冬蟲夏草更是具有有機硒的功能，同時具有冬蟲夏草的保健活性，目前多以牛肉膏蛋白胨等價格較貴的材料作為基質，而以廉價的啤酒糟作為基質生產很少。其工藝的優(yōu)化是一個非常復雜的動態(tài)過程，影響其結果的因素也很多，本研究通過單因素試驗和正交試驗，得到優(yōu)化發(fā)酵條件為搖床轉速為180 r/min，培養(yǎng)10 d，裝液量為50 mL/250 mL，pH值為7.0，接種量15%，溫度20 ℃，亞硒酸鈉質量濃度25 mg/L，啤酒糟質量濃度20 g/L。在此條件下，蟲草總富硒量為5 808.20 μg/L。本試驗確定冬蟲夏草富硒的最佳發(fā)酵條件，為以后的研究提供了一定的基礎，今后可進一步選育出優(yōu)良的冬蟲夏草菌株應用到發(fā)酵生產中。

[1]LIN Y W,CHIANG B H.Anti-tumor activity of the fermentation broth ofCordyceps militariscultured in the medium ofRadix astragali[J].Process Biochem,2008,43(3):244-250.

[2]ZHANG J L,YU Y C,ZHANG Z F,et al.Effect of polysaccharide from culturedCordyceps sinensison immune function and anti-oxidation activity of mice exposed to 60Co[J].Int Immunopharmacol,2011,11(12):2251-2257.

[3]DONG C H,XIE X Q,WANG X L,et al.Application of Box-Behnken design in optimization for polysaccharides extraction from cultured mycelium ofCordyceps sinensis[J].Food Bioprod Process,2009,87(2):139-144.

[4]XIAO J H,XIAO D M,XIONG Q,et al.Nutritional requirements for the hyperproduction of bioactive exopolysaccharides by submerged fermentation of the edible medicinal fungusCordyceps taii[J].Biochem Eng J,2010,49(2):241-249.

[5]LI S P,ZHAO K,JI Z N,et al.A polysaccharide isolated fromCordyceps sinensis,a traditional Chinese medicine,protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury[J].Life Sci,2003,73(19):2503-2513.

[6]CHEN J P,ZHANG W Y,LU T T,et al.Morphological and genetic characterization of a cultivatedCordyceps sinensisfungus and its polysaccharide component possessing antioxidant property in H22 tumor-bearingmice[J].Life Sci,2006,78(23):2742-2748.

[7]ZHANG W Y,LI J,QIU S Q,et al.Effects of the exopolysaccharide fraction(EPSF)from a cultivatedCordyceps sinensison immunocytes of H22 tumor bearing mice[J].Fitoterapia,2008,79(3):168-173.

[8]LEUNG P H,ZHAO S N,HO K P,et al.Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture ofCordyceps sinensisfungus Cs-HK1[J].Food Chem,2009,114(4):1251-1256.

[9]YAN J K,LI L,WANG Z M,et al.Structural elucidation of an exopolysaccharide from mycelial fermentation of aTolypocladiumsp.fungus isolated from wildCordyceps sinensis[J].Carbohyd Polym,2010,79(1):125-130.

[10]LIN R S,LIU H H,WU S Q,et al.Production andin vitroantioxidant activity of exopolysaccharide by a mutant,Cordyceps militarisSU5-08[J].Int J Biol Macromol,2012,51(1-2):153-157.

[11]OHTA Y,LEE J B,HAYASHI K,et al.In vivoantiinfluenza virus activity of an immunomodulatory acidic polysaccharide isolated fromCordyceps militarisgrown on germinated soybeans[J].J Agr Food Chem,2007,55(25):10194-10199.

[12]CHEN W X,ZHANG W Y,SHEN W B,et al.Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivatedCordyceps sinensison macrophagesin vitro[J].Cell Immunol,2010,262(1):69-74.

[13]WANG L,WANG G Y,ZHANG J J,et al.Extraction optimization and antioxidant activity of intracellular selenium polysaccharide byCordyceps sinensisSU-02[J].Carbohyd Polym,2011,86(4):1745-1750.

[14]LU Z Q,JIN M L,HUANG M,et al.Bioactivity of selenium-enriched exopolysaccharides produced byEnterobacter cloacaeZ0206 in broilers[J].Carbohyd Polym,2013,96(1):131-136.

[15]LIU L,PAN D D,ZENG X Q,et al.Effect of selenium-enriched exopolysaccharide produced byLactococcus lactissubsp lactis on signaling molecules in mouse spleen lymphocytes[J].Food Funct,2013,4(10):1489-1495.

[16]RAYMAN M P.The importance of selenium to human health[J].L ancet,2000,356(9225):233-241.

[17]O’DELL B L,SUNDE R A.Handbook of nutritionally essential mineral elements[M].New York:Marcel Dekker Inc,1997.

[18]GUO Y X,PAN D D,LI H,et al.Antioxidant and immunomodulatory activity of selenium exopolysaccharide produced byLactococcus lactissubsp lactis[J].Food Chem,2013,138(1):84-89.

[19]HE N W,SHI X L,ZHAO Y,et al.Inhibitory effects and molecular mechanisms of selenium-containing tea polysaccharides on human breast cancer MCF-7 cells[J].J Agr Food Chem,2013,61(3):579-588.

[20]SUN Y G,XIE X J,HE J P,et al.Enhancement of immune response for newcastle disease vaccine using a combined adjuvant solution of astragalus polysaccharides,levamisole,and selenoprotein[J].Turk J Vet Anim Sci,2013,37(5):516-522.