盧亞玲，王小楠，劉文杰 *，賈清華，蘆倩雯

（1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.塔里木大學(xué)分析測(cè)試中心，新疆 阿拉爾 843300）

啤酒花（Humulus lupulusL.）又名忽布（hop）、香蛇麻花、酒花、野酒花，為?？撇輰俣嗄晟示壊荼局参颷1]，酒花品種很多，分為苦味型和香味型兩種。酒花為貴重的特用經(jīng)濟(jì)作物，是釀造啤酒的重要原料。酒花中的主要成分能賦予啤酒柔和優(yōu)美的芳香和爽口的微苦味，能加速麥汁中高分子蛋白的絮凝，提高啤酒泡沫的起泡性和泡持性，也能增加啤酒的生物穩(wěn)定性，是釀造啤酒不可缺少的物質(zhì)[2-3]。目前，酒花中已檢測(cè)出數(shù)百種組成不同的有機(jī)化合物，其風(fēng)味特征是由一組化合物之間既獨(dú)立又相互協(xié)同而產(chǎn)生的[4]。而酒花中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分對(duì)其風(fēng)味影響較大。

新疆具有啤酒花生長(zhǎng)得天獨(dú)厚的自然條件，新疆啤酒花種植區(qū)域和種植品種較多，是世界三大啤酒花種植基地之一，種植面積和產(chǎn)量位居全國第一[5]。由于新疆的特殊氣候環(huán)境，新疆產(chǎn)地酒花在品種和質(zhì)量上也具有明顯的地域特征。

對(duì)于酒花及其產(chǎn)品中揮發(fā)性成分的分析，常用的萃取方法有水蒸氣蒸餾法、揮發(fā)油提取器提取法、連續(xù)液-液提取技術(shù)[6]、固相微萃取法等[7-9]，由于固相微萃取操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、樣品量少，適用于揮發(fā)性有機(jī)物、半揮發(fā)性有機(jī)物及不具揮發(fā)性的有機(jī)物，可以隨身攜帶，現(xiàn)場(chǎng)采集，并可在氣相色譜儀器上直接進(jìn)樣，提高了分析速度和檢測(cè)靈敏度[10-11]，采用固相微萃取方法萃取揮發(fā)性組分成為發(fā)展趨勢(shì)。因此，研究通過與揮發(fā)油提取器提取法比較，采用頂空-固相微萃取法-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectromeyry，HS-SPME-GC-MS）分析新疆產(chǎn)地啤酒花中的揮發(fā)性成分，由于酒花品種不同、產(chǎn)地的差異，揮發(fā)性組分的含量差別較大，因而采用SPSS軟件進(jìn)行聚類分析，以期為新疆酒花質(zhì)量的控制提供更好的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆青島大花（苦花，樣品7）、扎一顆粒啤酒花（樣品6）、馬可波羅顆粒啤酒花（樣品5）：新疆綠寶酒花有限公司；樣品1，2，3，4，8為采摘于昌吉、塔城及庫爾勒的啤酒花樣品。

無水硫酸鈉、無水乙醚均為分析純：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；Millipore超純水：美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Finnigan Trace GC-DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置電子電離源）：美國Thermo Fisher公司；BB89-2000揮發(fā)油提取器：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；VIC-412電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；SPE-12固相微萃取裝置：美國Superlco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GC-MS聯(lián)用條件

Finnigan Trace GC-DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱：DB-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）檢索譜庫：NIST、Replib、Mainlib。

色譜條件：起始柱溫40 ℃保持2 min，以5.5 ℃/min升溫至100 ℃保持1 min，以3.5 ℃/min升至120 ℃保持4 min，以2 ℃/min升至160 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min。載氣為He，流速1.2 mL/min，分流比1∶10，進(jìn)樣口溫度220 ℃，傳輸線溫度250 ℃。質(zhì)譜條件：離子源溫度220 ℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI），電子能量70 eV，掃描范圍50～400 amu。

1.3.2 固相微萃取方法

啤酒花樣品，于-20 ℃密封儲(chǔ)藏于冰箱中，使用前取出粉碎。用于提取方法比較的為苦花型青島大花。

采用靜態(tài)頂空固相微萃取法，準(zhǔn)確稱取0.15 g樣品，置于4 mL頂空樣品瓶中，于70 ℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min，吸附30 min。萃取完畢后，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜儀分析，萃取頭在220 ℃解析5 min。

1.3.3 揮發(fā)油提取器提取條件

稱取粉末樣品25 g，加入1 L水，連接揮發(fā)油提取器，提取4 h，直至無油分流出。收集揮發(fā)油成分，加無水硫酸鈉干燥，加乙醚定容至15 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種提取方法的比較

以固相微萃取與揮發(fā)油提取器提取樣品進(jìn)行比較，通過比較發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油提取器提取的目標(biāo)物較少，而固相微萃取可以萃取得到更多的目標(biāo)物峰。而且由于揮發(fā)油提取需要消耗較大的樣品量，提取效率也不夠高，因此，實(shí)驗(yàn)采用固相微萃取法萃取揮發(fā)性成分。

2.2 SPME萃取條件的選擇

為了確定SPME的最佳萃取條件，分別考察了不同萃取纖維、萃取溫度和萃取時(shí)間、萃取樣品量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。以苦花樣品中的揮發(fā)性組分α-蒎烯、2-十一酮，α-古巴烯，2-十二酮，β-石竹烯，α-石竹烯，γ-依蘭油烯，γ-杜松烯八種物質(zhì)的峰面積被用來確定最佳萃取條件。

2.2.1 萃取方式的選擇

準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，采用100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、75 μm CAR/PDMS、65 μm CW/DVB、30 μm PDMS萃取纖維頭，在60 ℃萃取30 min進(jìn)行比較，由圖1可知，100 μm PDMS纖維對(duì)這8種化合物的萃取效果更好，65 μm CW/DVB的萃取效果較好。而75 μm CAR/PDMS由于適合萃取極性物質(zhì)，很多物質(zhì)未萃取出來。因此，進(jìn)一步分析均采用100 μm PDMS纖維萃取。

圖1 不同萃取纖維對(duì)峰面積響應(yīng)值的影響Fig.1 Effect of different fiber on peak area response values

2.2.2 萃取溫度和萃取時(shí)間的選擇

萃取溫度和萃取時(shí)間是影響萃取速度和效率的重要因素[9]。高溫、長(zhǎng)時(shí)間有利于HS-SPME萃取，但溫度太高、時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)降低萃取頭的吸附能力。

圖2 不同萃取溫度對(duì)峰面積響應(yīng)值的影響Fig.2 Effect of different extraction temperature on peak area response values

萃取溫度的選擇：準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，利用100 μm PDMS纖維，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃條件下萃取30 min，進(jìn)行選擇最佳萃取溫度。結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著溫度的升高，選取的目標(biāo)物的響應(yīng)峰面積普遍增大，在70 ℃的萃取效果較好，溫度過高不利于操作進(jìn)行。

萃取時(shí)間的選擇：準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，利用100 μm PDMS纖維，在70 ℃分別萃取5 min、10 min、20 min、25 min、30 min、40 min，結(jié)果見圖3。由圖3可知，萃取時(shí)間為30 min時(shí)，選取的目標(biāo)物響應(yīng)都較高。

圖3 不同萃取時(shí)間對(duì)峰面積響應(yīng)值的影響Fig.3 Effect of different extraction time on peak area response values

2.2.3 不同樣品量的選擇

不同的樣品量影響萃取頭的萃取體積，對(duì)萃取效率的影響非常重要。分別準(zhǔn)確稱取0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g樣品，在優(yōu)化的萃取條件下進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)樣品量為0.15 g時(shí)，各選取的目標(biāo)物響應(yīng)都較好。

圖4 不同樣品量對(duì)峰面積響應(yīng)值的影響Fig.4 Effect of different sample loading on peak area response values

因此，在優(yōu)化的色譜條件下，選取樣品量為0.15 g，萃取溫度為70 ℃，萃取時(shí)間為30 min作為啤酒花樣品揮發(fā)性組分分析的條件。

2.3 固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用儀分析結(jié)果

在優(yōu)化的氣相色譜-質(zhì)譜條件下，可以分離出100多種成分，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)[12-14]能準(zhǔn)確鑒定出57種物質(zhì)。啤酒花油的主要成分為萜烯類化合物，占總酒花油的61.10%，如α-石竹烯、α-蒎烯；其次酯類化合物15種，占總酒花油的15.25%，如丁酸葉醇酯、丙酸葉醇酯、其次為醇類，占揮發(fā)油總量的3.95%；此外，還有少量的酮類、酮酸類、萜烯環(huán)氧化合物等。

2.4 聚類分析與判別分析

圖5為樣品中8種目標(biāo)物的含量圖。以所測(cè)酒花中的8種目標(biāo)物為變量，分別對(duì)8種產(chǎn)地的酒花進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖6和圖7。其中，樣品5為馬可波羅顆粒酒花，樣品6為扎一顆粒啤酒花，樣品7為青島大花，其他為采摘樣品。對(duì)選取的不同啤酒花品種進(jìn)行聚類分析，聚類分析是根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)本身所有的定量或定性的特征對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分組歸類以清楚數(shù)據(jù)集內(nèi)在結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)每一個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行描述過程的一種方法[15-16]。

圖5 酒花中8種目標(biāo)物的含量Fig.5 The content of 8 kinds of compounds in hops

圖6 聚類分析樹狀圖Fig.6 Dendrogram of cluster analysis

由圖5可知，樣品啤酒花中，α-葎草烯含量較高，其次是β-石竹烯，其他主要物質(zhì)含量相當(dāng)。由圖6、圖7可知，樣品2與樣品6歸為第1類，樣品7與樣品8歸為第2類，樣品3、4、5、1歸為第3類。三個(gè)組中心也就是聚類分析后得到的三種類別。

區(qū)別苦花型酒花與香花型酒花的主要因素是月桂烯（香葉烯）的含量，另一個(gè)區(qū)別是葎草烯與石竹烯的比值，香花型酒花的比值較高。苦型酒花與香型酒花具有明顯的區(qū)別，各物質(zhì)的含量有著明顯的差距。因此依據(jù)判斷，樣品7即新疆青島大花為苦花型啤酒花，樣品5馬可波羅顆粒為另一類苦花型啤酒花，樣品6扎一顆粒為香花型啤酒花，與實(shí)際符合，且能很好的判定其他幾種采摘酒花的品種和類型，得出樣品2為香型酒花，樣品1、3、4、8為苦型酒花。

圖7 Fisher非標(biāo)準(zhǔn)化典型判別分組圖Fig.7 Fisher typical non-standard discriminant group figure

3 結(jié)論

通過與揮發(fā)油提取器提取方法的比較，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）分析新疆產(chǎn)地啤酒花及顆?；ㄖ械膿]發(fā)性成分。獲得固相微萃取的最佳提取條件為：100 μm PDMS萃取纖維、萃取時(shí)間30 min，萃取溫度70 ℃，萃取樣品量0.15 g。在最優(yōu)萃取條件下對(duì)不同產(chǎn)地、不同品種的酒花進(jìn)行了聚類分析和判別分析，對(duì)不同酒花中揮發(fā)性成分的組成進(jìn)行了歸類。所得結(jié)果可靠，能有效的為啤酒花品種和品質(zhì)的鑒定提供依據(jù)，有利于對(duì)新疆酒花產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

[1]楊小蘭，田艷花，師成濱，等.啤酒花中黃腐酚的生理活性作用的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2007，28（7）：526-530.

[2]趙建英.酒花成分及其對(duì)啤酒質(zhì)量的影響[J].呂梁高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2010，26（2）：24-26.

[3]熊皓平.啤酒花化學(xué)成分及黃腐酚提純技術(shù)的研究[D].杭州：浙江大學(xué)博士論文，2005.

[4]劉玉梅.啤酒花的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（23）：521-527.

[5]趙素華，劉奎鈁，劉 罡，等.新疆啤酒花新品種阜北-1 的成分分析比較[J].西北植物學(xué)報(bào)，2000，20（6）：1110-1113.

[6]朱曉蘭，劉百戰(zhàn)，時(shí) 亮，等.啤酒花酊揮發(fā)性香味成分的GC-MS 分析[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2000，19（1）：59-63.

[7]KISHIMOTO T,WANIKAWA A,KONO K,et al.Comparison of the odor-active compounds in unhopped beer and beers hopped with different hop varieties[J].J Agr Food Chem,2006,54(23):8855-8861.

[8]HELMJA K,VAHER M,PüSSA T,et al.Bioactive components of the hop strobilus:Comparison of different extraction methods by capillary electrophoretic and chromatographic methods[J].J Chromatogr A,2007,1155:222-229.

[9]王 憬，崔巍偉，王莉娜，等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析啤酒的酒花香組分[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（8）：127-131.

[11]KATAOKA H,LORD H L,PAWLISZYN J.Applications of solidphase microextraction in food analysis[J].J Chromatogr A,2000,880(1-2):35-62.

[12]薛華麗，蒲陸梅.啤酒花固相微萃-氣質(zhì)聯(lián)用成分分析[J].中國釀造，2011，30（1）：170-172.

[13]FIELD J A.,NICKERSON G,JAMES D D,et al.Determination of essential oils in hops by headspace solid-phase microextraction[J].J Agr Food Chem,1996,44(7):1768-1772.

[14]李 紅，王云川，張五九，等.酒花油的HS-GC/MS 分析研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（10）：52-58.

[15]周雅蘭，張金生，李麗華.不同產(chǎn)地啤酒中無機(jī)元素的因子分析與聚類分析[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2012，48（1）：49-55.

[16]溫 靖，徐玉娟，肖更生，等.荔枝裂解色譜指紋圖譜及聚類分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（1）：146-148.