龐 博，王曉丹，魏燕龍，邱樹毅*

（1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州金沙窖酒酒業(yè)有限公司，貴州金沙 551800；3.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025）

以微生物菌種為核心的發(fā)酵工業(yè)，其菌種是關鍵[1]，目前的產(chǎn)香酵母主要屬于產(chǎn)酯酵母和假絲酵母，是中國白酒中酯香的主要產(chǎn)生菌[2]，主要能為不同種類的白酒產(chǎn)酯增香，去除雜味，協(xié)調(diào)酒體，改善白酒的質(zhì)量[3]，除了在白酒生香中有的廣泛應用，也逐漸適用于香料、果汁、食醋的生產(chǎn)加工中，所以具有高產(chǎn)酯能力、各種酯組合優(yōu)化的產(chǎn)酯產(chǎn)香酵母的選育，是目前釀造行業(yè)急需研究且非常有意義的課題[4]。

本實驗主要從醬香型大曲酒的大曲和酒醅中分離具有高產(chǎn)酯增香功能的酵母，進行發(fā)酵實驗并對菌種進行鑒定、保藏，也為利用該菌種進行原生質(zhì)體融合來選育能夠產(chǎn)香的釀酒酵母奠定基礎。本研究對該菌種的生物學特性進行了詳細的研究，并通過分子生物學手段進行初步鑒定，為后期進一步研究和在白酒中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅、大曲：金沙窖酒酒業(yè)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基[5]：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，瓊脂20 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL，氯霉素0.1 g。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[6]：馬鈴薯汁1 000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

（2）富集培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基：麥芽汁70 mL，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基[7]：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，葡糖糖2.0 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

（3）篩選培養(yǎng)基

小麥高粱培養(yǎng)基：小麥∶高粱的質(zhì)量比為1∶1，其中整粒高粱∶碎粒質(zhì)量比為3∶1，小麥全部粉碎，攪拌均勻后90 ℃潤糧5 h，高溫蒸汽，121 ℃滅菌20 min，裝瓶。

（4）鑒定培養(yǎng)基

玉米粉瓊脂培養(yǎng)基：在60 g 玉米粉中加入少量水調(diào)成糊狀，再加水至1 000 mL，攪拌均勻后80～90 ℃水浴1.5 h，之后過濾（中間攪拌3～4 次），濾液補加水至1 000 mL，再加瓊脂15 g，加熱融化，趁熱用脫脂棉過濾，分裝到試管和三角瓶內(nèi)，113 ℃滅菌30 min。

麥氏培養(yǎng)基：0.1%葡萄糖，0.18%氯化鉀，0.25%酵母膏，0.82%醋酸鈉，2%瓊脂，以蒸餾水1 000 mL配制，113 ℃滅菌30 min。

豆芽汁培養(yǎng)基：10%豆芽汁、0.5%葡萄糖，蒸餾水100 mL調(diào)配，pH 值自然。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸膏、2%瓊脂、蒸餾水100 mL配制。

尿素培養(yǎng)基[8]：蛋白胨0.1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g、尿素0.2 g、葡萄糖0.01 g、蒸餾水100 mL、酚紅（0.2%）0.4 mL、瓊脂2%，調(diào)pH至7.2 后過濾，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

EXTaq酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、10×PCR Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）引物：Invitrogen 合成；Marker（DL 2000）：上海欣百諾生物有限公司。

1.2 儀器與設備

DY-CX1A電泳儀：上海趙迪生物科技有限公司；ABI PCR 儀：北京新陽創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；ABI 3730XL 測序儀：北京新陽創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；TDZ5-WS離心機：上海喬躍電子有限公司；SZX-IS1A恒溫培養(yǎng)箱：北京陸希科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)香酵母的分離與篩選

（1）初篩

酒醅樣粉碎，分別取25.0 g粉碎樣品于三角瓶中，并加225 mL無菌生理鹽水及玻璃珠，搖床中振蕩搖勻30 min。無菌條件下吸取1 mL菌懸液于裝有9 mL生理鹽水的試管中，進行系列稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進行平板涂布于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上。28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d后挑取平板中酵母單菌落，于10 mL生理鹽水中制成菌懸液，再稀釋涂布到PDA固體培養(yǎng)基上，重復3～4次，直至獲得純菌種，分別斜面劃線低溫保藏。

（2）復篩

分別把初篩分離得到的菌株接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)36 h后吸取4 mL菌液接種到盛有200 g高粱小麥培養(yǎng)基的三角瓶中，加入20 000 U糖化酶。模擬醬香白酒窖池內(nèi)33 ℃發(fā)酵25 d，蒸酒，感官評定，初步篩選產(chǎn)香酵母。

1.3.2 GC-MS分析

通過GC-MS對產(chǎn)香酵母制備的酒樣進行風味成分檢測。分別取產(chǎn)香酵母所發(fā)酵的酒樣1 g，置于4 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm～50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在85 ℃頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解析3 min進樣。

色譜柱為ZB-5MSI彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫45 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（純度≥99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1.5 min。離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 125 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～450 amu。

對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質(zhì)譜圖，確定了揮發(fā)性化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對含量。

1.3.3 產(chǎn)醬香酵母的形態(tài)特征

（1）菌落形態(tài)觀察

將分離接種純化過的菌株接種于最小必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEA）固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)。

（2）細胞形態(tài)觀察

將分離接種純化過的菌株接種于MEA 斜面培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)36 h，無菌條件下用接種環(huán)挑取少許菌體置于載玻片上的無菌水中，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

（3）假菌絲觀察[9]

將分離接種純化過的菌株接種在玉米粉瓊脂平板上28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察假菌絲有無。

（4）子囊孢子的觀察[10]

將分離接種純化過的菌株接種于麥氏培養(yǎng)基斜面上，28 ℃培養(yǎng)7 d后用接種環(huán)挑取少量生長在葡萄糖醋酸鹽培養(yǎng)基中的釀酒酵母于載玻片上，制片，干燥、固定后用孔雀綠芽孢染液染色，晾干之后于油鏡下觀察子囊孢子。

1.3.4 產(chǎn)香酵母的代謝實驗

（1）糖發(fā)酵實驗[11]

為制備碳源饑餓酵母，將純化過的酵母于25 ℃在氮源基礎培養(yǎng)基上饑餓培養(yǎng)3 d，后2.5%的接種量接種到12.5%豆芽汁中（加20 g/L葡萄糖），28 ℃靜置發(fā)酵14 d，每天觀察其產(chǎn)氣狀況。

（2）硝酸鹽利用實驗[12]

為制備氮源饑餓酵母，將純化過的酵母先在25 ℃用碳源基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)5～7 d后稀釋涂布于碳源基礎培養(yǎng)基平板上，并點少量硝酸鹽于平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d，觀察試劑周圍是否有酵母菌落生長。

（3）產(chǎn)類淀粉化合物測定實驗[12]

純化過的酵母接種在蛋白胨酵母膏葡萄糖（YPD）培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)5～6 d后加入1滴Lugol’s 碘液，觀察是否產(chǎn)類淀粉化合物。

（4）脲酶實驗[12]

純化過的酵母接種于水解尿素實驗的瓊脂斜面上28 ℃培養(yǎng)6～7 d，觀察是否分解尿素。

1.3.5 產(chǎn)香酵母的ITSrDNA PCR測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

提取樣品基因組DNA，PCR引物：ITS1：（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'），ITS4：（5'-TCCCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。模板DNA 5 μL，反應體系50 μL，PCR Premix 25 μL，引物ITS1和ITS4各0.5 μL，將ddH2O補足至50 μL。PCR 反應條件為：94 ℃5 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，30個循環(huán)后瓊脂糖凝膠電泳檢測。將測序結(jié)果利用Blast 程序搜索同源序列，以Clustal X 軟件進行多重序列比對[13]，再用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母的感官評定

經(jīng)過初篩，共從大曲、酒醅中分離出12株菌落形態(tài)不同的菌株，可將其分為3類，其菌落形態(tài)描述見表1。

表1 酵母菌菌落形態(tài)描述Table 1 Colony morphology of yeasts

為了研究表1中12株3類不同酵母發(fā)酵產(chǎn)酒情況，將該12株酵母按照1.3.1的方法進行實驗室模擬發(fā)酵產(chǎn)酒，并感官評定，其中氣味強度按照數(shù)字1～10氣味強度逐漸升高，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，總體可接受性最大的為11號酵母，總體可接受性＞5的酵母為11號、10號、6號、2號酵母菌株，初步篩選出該4株產(chǎn)香功能酵母，進行后續(xù)實驗。

表2 不同酵母發(fā)酵產(chǎn)酒樣感官評定Table 2 Sensory evaluation of liquor samples

2.2 GC-MS分析

為分析初篩中4株酵母實驗室模擬發(fā)酵所蒸餾的酒樣中的風味成分，對酒樣進行了GC-MS分析，在4株酵母中對比篩選出1株產(chǎn)香優(yōu)勢酵母FBKL2.0011，其GC-MS分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 FBKL2.0011發(fā)酵酒樣揮發(fā)成分GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS analysis results of aroma components of liquor sample fermented by strain FBKL2.0011

通過GC-MS總離子流圖譜進行解析后，在FBKL2.0011菌株發(fā)酵制備的酒樣中共鑒定出43種揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果見表3。

由表3可知，F(xiàn)BKL2.0011菌株發(fā)酵酒樣中共檢出43種香氣成分，包括醇類、酸類、醛類、酯類、酮類、烯烴類、芳香類化合物及烷烴類。揮發(fā)性物質(zhì)中以醇類的含量最多，其中乙醇相對含量32.202%；其次是酯類如乙酸乙酯相對含量達8.009%。以醇類和酯類為主的香氣物質(zhì)共同形成了白酒香氣。

表3 FBKL2.0011菌株發(fā)酵制備的酒樣中香氣物質(zhì)組成Table 3 Aroma compositions in liquor sample produced by strain FBKL2.0011

續(xù)表

2.3 產(chǎn)香酵母的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察

菌株FBKL2.0011在MEA固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，其菌落形態(tài)結(jié)果見表4及圖2。

表4 FBKL2.0011菌株在MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的菌落形態(tài)Table 4 Colonial morphology of strain FBKL2.0011 cultured in MEA medium for 3 d

圖2 FBKL2.0011的菌落形態(tài)(A)及鏡檢圖(B)Fig.2 Colonial morphology (A) and microscopy examination (B) of strain FBKL2.0011

2.3.2 酵母菌部分代謝實驗

對酵母菌株FBKL2.0011進行生理生化特性試驗，其結(jié)果見表5。

表5 酵母菌生理生化特性形態(tài)Table 5 Physiological and biochemical properties of yeasts

由表5可知，酵母菌株FBKL2.0011無孢子，能利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生香氣成分，不能利用硝酸鹽，不產(chǎn)類淀粉物質(zhì)及不能分解尿素。

2.3.3 分子生物學鑒定

為了進一步確定該酵母的分類地位，又在形態(tài)學和生理生化的基礎上進行了分子生物學鑒定。采用ITS序列分析方法，對菌株DNA序列進行擴增，將擴增出的核酸片斷與Marker條帶比較，有一條明亮的PCR 特征性條帶，如圖3所示，并且其分子質(zhì)量大小與預測的理論值基本相符，菌株FBKL2.0011的PCR產(chǎn)物片段大小為817 bp。利用Blast程序與GenBank 中已登錄的基因序列進行比對，獲得已定名的與之相似的屬、種的相關信息。構(gòu)建發(fā)育樹和同源性分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株FBKL2.0011 與uncultured compost fungus 同源性最高為99%。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of PCR products

圖4 菌株FBKL2.0011的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequences of strain FBKL2.0011

通過以上形態(tài)、生理學特征采用《酵母菌特征及鑒定手冊》介紹的方法[15]對該酵母分類，并結(jié)合其分子生物學鑒定結(jié)果，判斷判菌株FBKL2.0011 為酵母屬（Saccharomyces）。

3 結(jié)論

從金沙窖酒酒醅中分離到一株產(chǎn)香菌株，通過形態(tài)學、生理生化試驗和分子生物學鑒定，確定FBKL2.0011為酵母屬（Saccharomyces）。FBKL2.0011菌株發(fā)酵酒樣中共檢出43種香氣成分，包括醇類、酸類、醛類、酯類、酮類、烯烴類、芳香類化合物及烷烴類。揮發(fā)性物質(zhì)中以醇類的含量最多，其中乙醇相對含量32.202%；其次是酯類如乙酸乙酯相對含量達8.009%。以醇類和酯類為主的香氣物質(zhì)共同形成了白酒香氣。

今后將對該菌與實驗室篩選的功能細菌和霉菌聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)酵條件進行研究與優(yōu)化，期望發(fā)現(xiàn)能夠提高白酒生產(chǎn)過程中的高級醇和酯類含量的一種方法。

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