吳均 陳苗苗 王穎 段萍 朱雪瓊

●論 著

mTOR-PKM2信號通路與宮頸鱗癌新輔助動脈化療療效的相關(guān)性研究

吳均 陳苗苗 王穎 段萍 朱雪瓊

目的 研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-丙酮酸激酶M2（PKM2）信號通路在宮頸鱗癌新輔助動脈化療前后的改變及其與化療敏感性的相關(guān)性，以期在化療前預(yù)測宮頸鱗癌對化療藥物的敏感性，使患者得到更加有效的個體化治療。方法選取2007—2012年因巨塊型Ⅰb～Ⅱa期宮頸鱗癌行新輔助動脈化療和宮頸癌根治術(shù)的患者36例，所有患者術(shù)前均接受以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，評估化療的療效。（1）采用Western blot法，檢測宮頸鱗癌組織中mTOR和PKM2蛋白的表達(dá)。（2）采用免疫組化SP法，檢測化療前后、化療有效組和無效組宮頸鱗癌組織中mTOR和PKM2的表達(dá)差異。結(jié)果（1）化療1～2個周期后，36例宮頸鱗癌患者中，19例為化療有效，17例為化療無效。（2）mTOR和PKM2蛋白在宮頸鱗癌組織中特異性表達(dá)。（3）mTOR和PKM2蛋白在化療后宮頸鱗癌組織中的表達(dá)均明顯低于化療前（均P＜0．05）。（4）化療前宮頸癌組織中mTOR和PKM2蛋白的表達(dá)在化療有效組中均比化療無效組中高（均P＜0．05）。結(jié)論早期巨塊型宮頸鱗癌組織中mTOR和PKM2蛋白的表達(dá)與新輔助動脈化療的療效相關(guān)?；熐皩m頸鱗癌組織中mTOR和PKM2蛋白的表達(dá)有可能成為宮頸癌新輔助動脈化療療效的預(yù)測指標(biāo)。

雷帕霉素靶蛋白 丙酮酸激酶M2 宮頸腫瘤 化療 新輔助

近年來，新輔助化療被廣泛用于治療局部晚期宮頸癌，尤其是巨塊型Ⅰb和Ⅱa期的宮頸鱗癌患者[1]。新輔助化療可以縮小腫瘤體積，減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，降低腫瘤的分期，提高隨后的手術(shù)切除率和放射治療的敏感性[2]。但并非每例患者都對化療藥物敏感，因此，在新輔助化療前預(yù)測宮頸癌對化療藥物的療效，以實現(xiàn)“預(yù)見性”的新輔助化療有著很重要的臨床意義。但是，目前尚無明確的預(yù)測新輔助動脈化療有效性的指標(biāo)。

糖酵解關(guān)鍵酶丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase type M2，PKM2）是雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路下游的一個主要效應(yīng)因子。大量研究表明，mTOR/PKM2信號級聯(lián)參與有氧糖酵解，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等相關(guān)[3-4]。同時，mTOR、PKM2與惡性腫瘤的化療敏感或耐藥相關(guān)[5-7]。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中PKM2的表達(dá)在化療后的表達(dá)明顯改變[8]，提示PKM2可能與宮頸癌新輔助動脈化療的療效相關(guān)。本研究采用免疫組化染色的方法，觀察宮頸鱗癌患者新輔助動脈化療前后宮頸癌組織中PKM2和mTOR蛋白的表達(dá)變化，尋找宮頸癌新輔助動脈化療療效相關(guān)的蛋白，以期在化療前預(yù)測腫瘤對化療藥物的敏感性，使患者得到更加有效的個體化治療。

1 對象和方法

1.1 對象 2007-01—2012-08在我院就診并因巨塊型（腫瘤直徑＞4cm）Ⅰb～Ⅱa期宮頸鱗癌行新輔助動脈化療和宮頸癌根治術(shù)的患者36例，術(shù)前未接受任何治療?；颊吣挲g25～62歲，中位年齡44歲。根據(jù)FIGO 2009年宮頸癌臨床分期，其中Ⅰb2期21例（58.3%），Ⅱa2期15例（41.7%）。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。接受新輔助動脈化療的患者均簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）活檢病理報告為宮頸鱗狀細(xì)胞癌；（2）治療前由2位婦科主任醫(yī)生三合診均診為Ⅰb或者Ⅱa期的宮頸鱗癌；（3）盆腔MRI檢查宮頸病灶直徑＞4cm；（4）骨髓造血功能無明顯受損：血白細(xì)胞數(shù)＞4.0×109/L，Hb＞80g/L，Plt＞100×109/L；（5）無明顯內(nèi)科合并癥，肝腎功能和心電圖正常；（6）Karnofsky評分≥80分；（7）患者依從性好，治療前均知情同意。

1.3 治療方法和療效判定 采用Seldinger技術(shù)，行雙側(cè)子宮動脈插管灌注化療加栓塞?；煼桨甘且皂樸K為主的聯(lián)合化療：順鉑50mg/m2+5-氟尿嘧啶500mg/m2+絲裂霉素8mg/m2，單次灌注。根據(jù)化療療效分別給予1～2個療程的化療。所有患者均在化療結(jié)束后14～22d行廣泛全子宮切除加盆腔和（或）腹主動脈旁淋巴結(jié)清掃術(shù)。

1.4 化療療效判定 患者接受化療前通過婦科檢查及影像學(xué)檢查測量病灶大小，動脈化療結(jié)束后2周時根據(jù)WHO實體瘤的近期療效評定標(biāo)準(zhǔn)評估化療療效[9]，采用陰道B超和（或）MRI測量病灶的最大直徑及其最大垂直橫徑，用兩者的乘積來評估局部癌灶的變化。完全緩解：指腫瘤完全消失，部分緩解：指腫瘤縮小50%以上；穩(wěn)定：指腫瘤縮小不足50%或增大不超過25%；進(jìn)展：指腫瘤增大超過25%或有新病灶出現(xiàn)?；熀髮m頸局部癌灶完全緩解或部分緩解為化療有效組，化療后局部癌灶穩(wěn)定或進(jìn)展為化療無效組[8]。

1.5 標(biāo)本收集及處理 在化療前和手術(shù)中獲得局部宮頸癌組織標(biāo)本。10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，制成蠟塊，切片。每例病例均經(jīng)HE常規(guī)染色，由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生確診為宮頸鱗癌。

1.6 試劑和儀器 兔抗人多克隆抗體PKM2購自美國CST公司。兔抗人多克隆抗體mTOR購自英國的Abcam公司。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）購自美國Pierce公司。鼠抗人單克隆抗體GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。SP-9000過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。GS-800掃描儀購自美國Bio-Rad公司。

1.7 免疫印跡（Western blot）方法 RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50μg蛋白質(zhì)于8%十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，先70V電泳40min，然后120V電泳50min，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，用300mA恒流轉(zhuǎn)移目的蛋白（PKM2轉(zhuǎn)移60min，mTOR轉(zhuǎn)移120min）。用含5%脫脂奶粉和Tween-20的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液于室溫中振蕩封閉2h。分別加入相應(yīng)一抗（兔抗人PKM2、mTOR，稀釋度均為1∶1 000；鼠抗人GAPDH抗體，稀釋度1∶500）。4℃搖床過夜后，分別加入相應(yīng)二抗（用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠，稀釋度1∶1 000）；ECL化學(xué)發(fā)光溶液中反應(yīng)，顯影、定影。膠片由GS-800掃描儀掃描。

1.8 免疫組化方法和結(jié)果判定 使用免疫組化SP法。切片脫蠟入水，浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽（pH 6.0）中行微波修復(fù)，先中高火5min，停5min后再中高火5min，3%H2O2阻斷過氧化物酶活性20min，山羊血清室溫孵育30min。然后滴加相應(yīng)一抗（兔抗人多克隆抗體PKM2、mTOR，均為1∶100稀釋），4℃過夜。生物素標(biāo)記二抗室溫孵育30min，后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15min，DAB顯色，顯微鏡觀察，水洗終止，蘇木素復(fù)染，淡氨水返藍(lán)，樹脂封片，光鏡下觀察。每一批染色均設(shè)陰性和陽性對照。以PBS代替一抗作陰性對照，PKM2用已知有陽性表達(dá)的肺癌切片作為陽性對照，mTOR用已知有陽性表達(dá)的前列腺癌切片作為陽性對照。PKM2和mTOR陽性染色表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片觀察10個隨機(jī)400倍視野，每個視野觀察100個細(xì)胞，根據(jù)免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行陽性率及著色強(qiáng)度評分。陽性率評分：＜5%為0分，6%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，＞75%為4分；著色強(qiáng)度：無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，深棕色為3分；將陽性百分率和著色強(qiáng)度兩項評分的乘積進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料對數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)（P25～P75）表示其分布特征。宮頸癌化療前、后組織中表達(dá)的差異采用配對秩和檢驗?；熐皩m頸癌中的兩種蛋白質(zhì)在化療有效組與化療無效組之間的表達(dá)差異采用Mann-Whitney U法。

2 結(jié)果

2.1 宮頸中分化鱗癌組織中PKM2和mTOR蛋白的特異表達(dá) 見圖1。

圖1 宮頸中分化鱗癌組織中PKM2和mTOR蛋白的特異表達(dá)（Pre：化療前組織；Post：化療后組織）

2.2 mTOR和PKM2蛋白在化療前后宮頸癌組織中的表達(dá)差異 見表1、圖2-3。

表1 PKM2和mTOR在化療前后宮頸癌組織中的表達(dá)情況［中位數(shù)（P25～P75）］

由表1可見，PKM2和mTOR蛋白在化療后宮頸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度均低于化療前宮頸癌組織中的表達(dá)（均P＜0.05）。

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局部署，中國食品藥品檢定研究院承擔(dān)了白礬的專項抽驗任務(wù)，對從全國25個省、市、自治區(qū)的91家飲片生產(chǎn)企業(yè)抽取的119批樣品進(jìn)行了評價性檢驗。具體抽樣情況見表1。

2.3 化療前宮頸鱗癌組織中PKM2和mTOR蛋白在化療有效組和化療無效組的表達(dá)差異 36例巨塊型Ⅰb-Ⅱa宮頸鱗癌患者中，19例為化療有效組，17例為化療無效組。化療前宮頸鱗癌組織中PKM2和mTOR蛋白兩組中的表達(dá)差異，見表2。

由表2可見，化療前宮頸鱗癌組織中PKM2和mTOR蛋白在化療有效組中的表達(dá)強(qiáng)度均高于化療無效組（均P＜0.05）。

圖2 化療前、后宮頸鱗癌組織中PKM2的表達(dá)[A：化療前；B：化療后（SP法，×400）]

3 討論

研究表明，新輔助化療的療效是巨塊型Ⅰb和Ⅱa期宮頸癌患者獨立的預(yù)后因素，對新輔助化療有效者提示患者有更長的無腫瘤進(jìn)展時間和總的生存時間[1]。但并非每例患者都對化療藥物敏感，有部分患者對化療藥物耐藥，其長時間使用不敏感的藥物，則會延誤確切的手術(shù)和（或）放療時間。在我們的前期工作中，運用雙向電泳技術(shù)比較宮頸鱗癌新輔助動脈化療有效組中化療前、后的差異蛋白，再用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜來鑒定這些差異蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中PKM2的表達(dá)在化療后的表達(dá)明顯改變[8]，mTOR是一種高度保守的蛋白質(zhì)，屬于磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族。mTOR/PKM2信號傳導(dǎo)通路在乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、存活以及調(diào)控細(xì)胞周期等多個方面發(fā)揮重要的作用[3-4]。國內(nèi)外研究表明，mTOR/PKM2信號傳導(dǎo)通路與惡性腫瘤的化療療效相關(guān)[5-7]。

歐柳菁等[5]研究發(fā)現(xiàn)，mTOR的活化狀態(tài)與包含紫杉醇方案的乳腺癌新輔助化療的療效相關(guān)。PKM2在胃癌SNU-638順鉑耐藥株中的表達(dá)較胃癌SNU-638細(xì)胞株中明顯下降，抑制胃癌細(xì)胞株SNU-638中PKM2的表達(dá)會引起對順鉑的耐藥[6]。Huang等[7]采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析奧利司他處理后卵巢癌SKOV3細(xì)胞系中的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)PKM2的表達(dá)明顯下調(diào)。mTOR與宮頸癌新輔助化療療效之間的相關(guān)性僅見Faried等[10]報道，而PKM2與宮頸癌新輔助化療療效之間的相關(guān)性尚未見報道。

本研究主要通過免疫組化方法檢測宮頸鱗癌患者在新輔助動脈化療前、后mTOR和PKM2蛋白的表達(dá)變化，探討了mTOR和PKM2表達(dá)與宮頸鱗癌新輔助動脈化療療效的關(guān)系及可能的機(jī)制。結(jié)果顯示，與化療前相比，mTOR和PKM2蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)在化療后均明顯下調(diào)，推測與順鉑聯(lián)合化療藥物抑制了腫瘤細(xì)胞的糖酵解活動有關(guān)。

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（本文編輯：沈昱平）

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mTOR-PKM2 signaling pathway in relation to sensitivity of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy for cervical squamous cancer

Objective To explore the relationship of rapamycin(mTOR)-pyruvate kinase M2(PKM2)signaling pathway with the sensitivity of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy for patients with cervical squamous cancer．MethodsThirty-six patients with stage Ib or IIa bulky squamous cervical cancer who underwent cisplatin-based neoadjuvant intra-arterial chemotherapy and radical hysterectomy between 2007 and 2012 in Wenzhou Medical University were enrolled．The expression of mTOR and PKM2 protein were examined by Western blotting in cervical squamous cell carcinoma before chemotherapy．The expression of mTOR and PKM2 in tumor was detected by streptavidin peroxidase(SP)immunohistochemical staining before and after chemotherapy and in chemotherapy-response patients and non-response patients．ResultsAfter one or two cycles of chemotherapy,19 cases responded to chemotherapy and 17 cases did not respond．Western blotting revealed than mTOR and PKM2 proteins were positively expressed in cervical squamous cell cancer．The expression of mTOR and PKM2 in tumor cells after chemotherapy was significantly lower than that before chemotherapy(P＜0．05)．Before chemotherapy the expression of mTOR and PKM2 in chemotherapy-response group was significantly higher than that in non-response group(P＜0．05)．ConclusionThe expression of mTOR and PKM2 in early stage cervical squamous carcinoma is associated with the response to neoadjuvant arterial chemotherapy,which may be used as a predictor for response to chemotherapy．

mTOR PKM2 Uterine cervical neoplasms Chemotherapy Neoadjuvant

2013-09-23）

浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才資助項目（2010-21）；國家自然科學(xué)基金項目（30700195）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科

朱雪瓊，E-mail:zjwzzxq@163.com